李 琴，杨清松，徐 彬，毛建文

(广东药学院，广州510006)

免疫荧光技术是生命科学和医学检验中常用的蛋白表达分布的检测手段，具有特异性强、敏感性高、速度快等优点。其基本原理为利用抗体和抗原的特异结合，在抗体上耦联荧光物质，通过激发光的激发，观测荧光在组织和细胞中的位置及其强度，以推断目的蛋白的表达位置及表达强度，以此获知机体可能出现的病理性变化，同时也可用于研究疾病与特定生物大分子之间的关系及其机理［1］。红细胞是血液中最主要的血细胞，其主要生理功能为运载氧气，同时也在机体免疫识别和应答中起作用［2］。哺乳动物和人的成熟红细胞为双凹圆盘结构，无细胞核，细胞内主要为血红蛋白，细胞骨架系统薄弱，细胞膜脆弱，对环境刺激敏感，极易发生细胞破碎、溶血。在红细胞的免疫荧光检测技术中，细胞膜完整时抗体难以进入细胞内，破膜处理则极易使红细胞溶血，导致难以在红细胞进行免疫荧光细胞化学的检测［3，4］。氯通道蛋白 ClC-3是电压门控氯通道的ClC家族成员之一。ClC-3蛋白主要表达于细胞质内的囊泡膜和胞膜［5］。胞膜ClC-3被认为是最可能编码容积激活性氯通道的基因，通过容积激活性氯电流参与细胞容积的调节，从而涉及细胞增殖、分化和迁移的调控［6］;囊泡膜上的ClC-3则作为氯通道参与了囊泡的酸化过程［7］。2012年3月1日～7月30日，我们通过优化固定液、透膜液、封闭液和洗涤液，解决了常规免疫细胞化学法导致红细胞易溶血的缺点，建立了一种不溶血的红细胞免疫荧光细胞化学检测方法。现介绍如下。

1 材料与方法

1．1 实验材料与试剂 红细胞来源于SD大鼠;兔抗人(鼠)ClC-3抗体购自Abcam公司;Alexa Fluor 488标记山羊抗兔购自碧云天;多聚赖氨酸(0．5 mg/mL)处理的载玻片。PBS缓冲液:NaCl 137 mmol/L，KCl 2．7 mmol/L，K2HPO48．1 mmol/L，KH2PO41．5 mmol/L。固定液:0．5%丙烯醛溶于PBS缓冲液。透膜液:含0．1 mol/L甘氨酸和0．1%的Triton X-100的PBS溶液。封闭液:含0．05 mmol/L 甘氨酸、2%BSA、0．05%NaN3的PBS溶液。洗涤液:含0．1 mol/L甘氨酸和5 mmol/L葡萄糖的PBS溶液。

1．2 方法 ①细胞采集:取SD大鼠尾静脉血5 μL，置1．5 mL的EP管中［预先加入20μL的EDTA(15 g/L)的PBS溶液］，混匀，加入175μL的PBS，混匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清再用PBS清洗2次，细胞备用。②细胞涂片:将备用细胞用0．4 mL PBS稀释，取40μL，用玻片离心机1 000 r/min离心5 min后涂片。③细胞固定:细胞涂片加固定液40 μL，室温固定5 min。④透膜:轻轻吸去细胞涂片上的固定液，加透膜液(先行最适透膜液浓度梯度实验，以确定最合适的透膜液浓度)40μL，室温作用3 min。⑤封闭:细胞涂片用洗涤液洗3次，每次5 min，封闭液30μL作用60 min，吸出封闭液。⑥孵育一抗:将兔抗人(鼠)ClC-3抗体(1∶50稀释)10 μL加至细胞涂片，4℃孵育过夜，洗涤液洗3次，每次5 min。⑦孵育二抗:Alexa Fluor 488耦联的山羊抗兔(1∶100稀释)15μL加至细胞涂片，室温避光孵育1 h，洗涤液洗3次，每次5 min。⑧染核:细胞涂片加细胞核染色液(DAPI)10μL，室温染色5 min，PBS洗3次，每次5 min。⑨封片及观察:细胞涂片滴加适量的抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片后激光共聚焦显微镜下观察。

2 结果

2．1 最适透膜液浓度 红细胞细胞免疫荧光实验中除了固定液成分容易导致溶血外，透膜处理是另一极易引起红细胞膜裂解的环节。针对这一问题，对红细胞对透膜液(Triton X-100)的耐受性进行了检测，结果显示，Triton X-100浓度约为0．01%时红细胞不会出现溶血现象(表1)。

表1 最适透膜液浓度梯度实验结果

2．2 红细胞ClC-3蛋白的表达 激光共聚焦显微镜下观察结果见图1。图1Aa为大鼠红细胞经过0．5%丙烯醛和0．01%的Triton X-100处理后在显微镜下明场观察的结果，可见红细胞仍呈典型的双凹碟盘状结构，仍然保持细胞结构的完整。图1Ab、图1Ac为荧光染色后的红细胞，其绿色荧光信号主要集中在细胞周缘，提示ClC-3在正常红细胞主要表达于细胞膜，与血中有核细胞同时表达在胞膜和胞质的特点差别明显(图1B)。

3 讨论

红细胞的细胞膜比较脆弱，易发生溶血现象［8，9］。选用合适的固定剂，可有效防止细胞的破碎。常用的红细胞固定剂有甲醇、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛等［10～12］。经过试用，我们用 0．5%丙烯醛作固定剂得到了较好的效果。其发挥作用的原理可能为丙烯醛的醛基与膜蛋白上的氨基交联，形成网络，从而加强了红细胞膜的机械强度［13，14］。

免疫荧光中使用的抗体所抗区段为的目蛋白的胞内区段时，必须使用表面活性剂，有效地使细胞膜穿孔，便于抗体进入，以同目的蛋白结合，但同时又不能过量，以保持细胞的稳定性。常用的表面活性剂有 Triton X-100［15］、Tween-20 等。对于这种低用量的试剂由于生产厂家或批次不同，细小的质量差异可能会引起使用效果的很大差异。通常的应对措施是减少改换试剂，对新的试剂使用浓度进行梯度实验，找寻最佳浓度。本实验兼顾细胞透膜和细胞膜固定强度的调试，有效地达到抗体透过细胞膜的目的，同时维持细胞的结构稳定，防止溶血。对红细胞的氯通道ClC-3蛋白进行检测，取得了良好效果。同时，利用本方法可进行其他红细胞胞膜和胞内蛋白等的定位和定量分析。

图1 激光共聚焦显微镜下鼠血细胞荧光ClC-3染色图像

总之，本研究通过优化固定液、透膜液、封闭液和洗涤液，解决了常规免疫细胞化学法导致红细胞易溶血的缺点，在确保红细胞不溶血的同时成功检测到红细胞氯通道ClC-3蛋白，即成功建立了一种不溶血的红细胞免疫荧光细胞化学检测方法。

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