徐香兰，韩 冰，钟启平，王 丽，燕 杰

(1天津医学高等专科学校，天津300222;2天津市第三中心医院;3天津医科大学)

舌癌多数为鳞癌，尤其在舌体前2/3部位的舌癌，常为溃疡型或浸润型，一般恶性程度较高，发病早期易发生隐匿性淋巴结转移，隐匿性淋巴转移率为20% ～50%［1，2］，患者 5 年生存率一般为 60%，10年以上的生存率更低，治疗效果不理想。因此，有关舌癌发生、发展及转移的机制成为了研究的热点问题。实体肿瘤中缺氧是一种常见的现象［3］，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是肿瘤缺氧适应的关键调节因子［4］，HIF-1α的高表达与肿瘤浸润程度、转移和不良预后的关系及其对肿瘤细胞生物学行为的影响研究较少，尤其是HIF-1α在舌癌细胞侵袭和迁移中的作用研究甚少，且其调控机制尚不清楚。2010年6月～2012年7月，我们通过RNA干扰技术降低舌癌细胞中HIF-1α的表达，探讨HIF-1α在舌癌细胞侵袭和迁移中的作用及其可能的分子机制，为抑制舌癌转移寻找新的靶点。

1 材料与方法

1．1 材料 ①细胞株:人舌癌细胞Tca8113购自美国ATCC细胞库。②主要试剂:DMEM培养基及胎牛血清购自Hyclone公司;细胞培养板购自Corning公司;HIF-1α、β-actin与 Fibronectin的抗体购自Santa Cruz公司;E-cadherin、α-SMA 和 vimentin的抗体购自AbCam公司;LipofectamineTM2000脂质体、TRIzol试剂购自 Invitrogen公司;CoCl2购自 Sigma公司;ECL试剂盒购自Millipore公司;pGCsi-H1/Hygro/GFPshRNA表达载体购自上海吉凯公司。

1．2 主要实验方法

1．2．1 舌癌细胞Tca8113的培养与转染 将3个shRNA序列质粒导入pGCsi-H1/Hygro/GFPshRNA质粒表达载体(上海吉凯公司)。以下是由吉凯公司设计合成的3个嵌入载体的shRNA干扰序列(小写表示插入干扰序列)。Verctor1 91-1:5'-GATCCCgactgatgaccagcaacttgaTTCAAGAGAtcaagttgctggtcatca gtcTTTTTGGAT-3';Verctor2 90-1:5'-GATCCCgcacaggccacattcacgtataTTCAAGAGAtatacgtgaatgtggcctgtgcTTT TTGGAT-3';Verctor3 89-1:5'-GATCCCgaggaagaactatgaacataaTTCAAGAGAttatgttcatagttcttcctcTTTTTGGAT-3'。重组体转化大肠杆菌DH5α，筛选潮霉素抗性克隆，提取质粒，测序法鉴定重组质粒，分别定为sh1、sh2、sh3。同时设置一个阴性对照，即把所设计的shRNA的核苷酸序列打乱，使其在干扰中不能发挥作用，用来排除质粒载体和与载体相连对其他功能基因的干扰，此为阴性对照质粒ctrl。

将人舌癌细胞Tca8113置于含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2孵箱中孵育3 d后，弃去未贴壁细胞，常氧环境继续孵育。将生长良好的舌癌细胞Tca8113用胰蛋白酶消化，取细胞1×105/mL，接种于6孔板，培养至80%融合，在LipofectamineTM2000脂质体介导下进行HIF-1α shRNA 质粒(sh1、sh2、sh3)和阴性对照质粒ctrl的转染(分别为siHIF-1α组和空载组)，空白对照孔加入含相同浓度脂质体的10%胎牛血清的DMEM培养液，6 h移去含脂质体的培养液，换为含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养24 h。半定量RT-PCR和Western blot法确定HIF-1αshRNA干扰效果。选择转染干扰效果最佳序列的细胞，加入潮霉素筛选，经过6～8周的培养，筛选出表达绿色荧光蛋白(GFP)且有潮霉素抗性的阳性细胞克隆株，使用含有潮霉素的培养基继续培养并用于后续实验。

1．2．2 舌癌细胞Tca8113中HIF-1αmRNA及蛋白的检测 分别采用半定量RT-PCR和Western blot法。上述各组舌癌细胞在低氧诱导培养液(加入化学缺氧剂CoCl2，终浓度为150μmol/L)中培养48 h(空载组分别进行常氧培养和低氧培养)。Trizol提取细胞总RNA，取3μg的RNA参照逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，HIF-1α上游引物为5'-GGACAAGTCACCACAGGA-3'，下游引物为5'-GGAGAAAATCAAGTCGTG-3'，片段大小168 bp，以β-actin作为内参。PCR条件:95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，53．3 ℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环后，72℃继续延伸10 min。取5μL的 PCR反应产物于1．5%琼脂糖凝胶进行电泳。

采用RIPA法提取舌癌细胞总蛋白，蛋白定量(BCA法)后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加HIF-1α抗体4℃孵育过夜，洗涤后加辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠HIF-1α的二抗，室温水平振摇1 h后，加入ECL发光剂显色，胶片曝光检查蛋白表达水平，以β-actin作为内参照。

1．2．3 舌癌细胞Tca8113的迁移能力检测 采用划痕实验。分别取空载组和siHIF-1α组(转染干扰效果最理想的HIF-1αshRNA质粒的细胞)生长期细胞1×104/mL，按照一定的密度铺在35 mm的培养皿中，生长后2 d，在培养皿底部用无菌20μL枪头划出比较均匀的划痕，在不同的时相(3、9、12 h)记录划痕的宽度，并计算出细胞移动的距离。实验重复3次，取平均值。

1．2．4 舌癌细胞Tca8113侵袭能力检测 采用细胞侵袭实验。在冰上将 Matrigel胶与无血清的DMEM培养基以1∶5比例稀释，然后在12孔transwell小室中每孔滴入120μL，置于37℃温箱孵育1 h，使基质胶凝固。消化重悬取空载组和siHIF-1α(转染干扰效果最理想的HIF-1αshRNA质粒的细胞)细胞，调整细胞密度为5×105/mL，将400μL细胞悬液加入transwell上室，800μL含10%血清的培养基加入transwell下室，37℃温箱孵育48 h后，小心去掉Matrigel胶，擦去未穿过膜的细胞，4%多聚甲醛(PFA)固定10 min，然后用0．005%结晶紫染色40 min，200倍显微镜下观察透过膜的细胞，随机取5个视野计数。实验重复3次，取平均值。

1．2．5 舌癌细胞Tca8113上皮—间质转化(EMT)相关标志蛋白和黏着斑激酶(FAK)及磷酸化FAK(p-FAK)的检测 采用 Western blot法。同上述HIF-1α蛋白的检测，只是针对检测蛋白的不同，一抗有所区别，siHIF-1α组细胞转染后低氧培养48 h后检测。以未转染任何质粒的Tca8113作对照(对照组)

1．3 统计学方法 采用SPSS17．0统计软件。两组间均数比较用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 HIF-1αshRNA重组质粒的电泳结果 重组后带有shRNA的质粒电泳图显示为6 338 bp，说明提取物为所需质粒(图1)。

图2 舌癌细胞Tca8113中HIF-1αmRNA及蛋白的表达

表1 不同培养时间两组舌癌细胞Tca8113迁移的距离比较(mm，¯x ±s)

2．5 舌癌细胞Tca8113中EMT相关标志蛋白检测结果 与对照组相比，siHIF-1α组E-钙黏素(E-cadherin)表达明显增加，波形蛋白(Vimentin)、纤维黏连蛋白(Fibronectin)、平滑肌动蛋白(α-SMA)表达明显减少，见图3。

图3 舌癌细胞Tca8113中EMT相关标志蛋白的表达

2．6 舌癌细胞Tca8113中FAK及p-FAK检测结果

与对照组相比，siHIF-1α组FAK表达无明显变化，但其p-FAK表达明显减少，见图4。

图4 舌癌细胞Tca8113中FAK及其p-FAK的表达

图1 HIF-1αshRNA重组质粒的电泳图

2．2 HIF-1αshRNA干扰效果 根据半定量RT-PCR和Western blot法检测到的舌癌细胞Tca8113中HIF-1αmRNA及蛋白，转染sh3质粒对HIF-1α的干扰效果最理想，可作为成功沉默HIF-1α的序列(图2)。

2．3 舌癌细胞Tca8113的迁移能力 空载组和siHIF-1α组培养3、9、12 h舌癌细胞Tca8113迁移的距离(mm)比较见表1。

2．4 舌癌细胞Tca8113的侵袭能力 空载组与siHIF-1α组侵袭细胞数分别为(67．07 ±2．02)个和(35．20 ±11．42)个，两组相比，P ＜0．05。

3 讨论

肿瘤细胞对缺氧的适应导致其对放化疗的抗性增加，而且使其侵袭性表型增加，从而导致肿瘤的转移。许多因素参与肿瘤细胞对缺氧微环境的适应及肿瘤细胞特性改变的调节，其中HIF-1α是重要的调节因子之一。研究［5］发现，HIF-1α直接调控的与缺氧适应有关的下游靶基因有100多个，HIF-1α通过不同的信号通路及机制调控肿瘤细胞的多种生物学行为，如细胞糖酵解、促血管生成及细胞的增殖、凋亡、侵袭等过程。为进一步探讨HIF-1α在肿瘤的生物学进程及其信号通路中的调控作用，本实验采用RNA干扰技术将HIF-1αshRNA表达载体通过脂质体转染到舌癌细胞Tca8113中，观察HIF-1α表达下降对舌癌细胞的迁移及侵袭能力的影响。结果显示，空载组细胞明显向划痕的中间迁移生长，而siHIF-1α组细胞的迁移能力显著减弱;空载组的Tca8113细胞穿透Matrigel胶的能力也明显高于siHIF-1α组。表明HIF-1α表达下降明显抑制了舌癌细胞的迁移及侵袭能力。

有研究［6］表明，尽管HIF-1α通过调节自身代谢和促进血管的生成在一定程度上缓解肿瘤细胞对缺氧的耐受，但肿瘤细胞最终还是会离开原位向氧和营养供给充足的部位转移，而肿瘤细胞进行EMT是肿瘤实现侵袭的必要条件［7］。EMT使细胞丧失上皮表型，如E-cadherin、角蛋白丝，同时获得间质表型，如 Vimentin、Fibronectin、α-SMA、N-钙黏素等。肿瘤细胞通过EMT摆脱细胞之间的连接，从而获得突破基底膜、侵袭周围组织的能力［8］。本研究发现，siHIF-1α组E-cadherin表达明显增加，Vimentin、Fibronectin、α-SMA表达明显减少，表明沉默HIF-1α基因表达可逆转细胞的EMT表型，即抑制上皮细胞向间质细胞转分化的现象，从而抑制肿瘤侵袭和转移。Chen等［9］研究发现，HIF与 Notch信号通路的靶基因HES1的启动子相结合可诱导乳腺癌EMT发生，这与本研究结果一致。当然，HIF-1α不是与肿瘤侵袭和转移相关的惟一调控基因，并且细胞对低氧的反应及Notch信号通路的相互调节也非常复杂，其相关机制有待于进一步研究。研究［10］发现，FAK在许多肿瘤中过表达，通过多条信号通路调控细胞侵袭、迁移、增殖及凋亡等，从而参与肿瘤的发生、发展进程，尤其对于整合素介导的血液循环中肿瘤细胞的黏附及转移非常重要［11，12］。FAK 的主要调节方式是依赖整合素和细胞外基质的黏附，从而促进其自身磷酸化，促进细胞运动。本研究中siHIF-1α组的FAK表达无明显变化，但其P-FAK表达显著下降。表明通过抑制HIF-1α的基因表达，可影响FAK自身磷酸化，在一定程度上可以逆转肿瘤的恶性表型。

RNA干扰沉默HIF-1α基因能有效地抑制舌癌细胞的迁移和侵袭能力，具有明显降低舌癌细胞恶性表型的作用。因此，抑制HIF-1α基因的表达可能为抗舌癌细胞的侵袭和转移提供一个新的靶位。

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