张光孜刘文志* 高海德柳仲林李兴中

（1 大连大学附属中山医院普外5科，辽宁 大连 116001；2 大连大学附属中山医院，辽宁 大连 116001；3 大连大学附属中山医院普外科，辽宁 大连 116001）

检测化疗药联合TRAIL后对胃肠道肿瘤细胞的影响

张光孜1刘文志2* 高海德3柳仲林3李兴中3

（1 大连大学附属中山医院普外5科，辽宁 大连 116001；2 大连大学附属中山医院，辽宁 大连 116001；3 大连大学附属中山医院普外科，辽宁 大连 116001）

目的 探讨化疗药联合 TRAIL 后对胃肠道肿瘤细胞存活和凋亡的影响。方法 单纯用化疗药抑制肠癌细胞为对照组，化疗药联合TRAIL 抑制肠癌细胞为实验组，两组均用 MTT 法测定存活率和 Annexin V/PI 染色流式细胞术检测细胞凋亡。结果 实验组的肠癌细胞存活率低于对照组，而凋亡率明显高于实验组，差异 P ＜ 0.05 具有统计学意义。结论 化疗药联合 TRAIL 能有效降低抑制胃肠道肿瘤细胞的生长，促进凋亡，降低存活率，提高凋亡率。

化疗药；TRAIL；胃肠道肿瘤细胞

近年来，肿瘤患病率逐年升高，其产生的症状对患者的身体质量水平产生严重影响。提高化疗药物的靶向性，降低其临床产生的毒性，已经成为现代抗肿瘤药物的研究热点[1]。TRAIL是在研究肿瘤性质细胞、病毒感染性细胞以及转化性细胞中发现的一种可以促进以上细胞不断病变坏死，而对人体内正常细胞却无产生较明显毒性消极作用。本文检测化疗药联合TRAIL后对胃肠道肿瘤细胞的影响，取得满意的结果，现将具体过程报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

肠癌细胞组织由我院肿瘤免疫实验室提供；化疗药替吉奥由齐鲁制药有限公司生产，国药准字为H20100151；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）5μg/mL由上海彩佑生物化工有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 肠癌细胞株培养方法

将肠癌细胞株置入含有新生牛血清的RPMI 1640完全培养液中，其中，新生牛血清的浓度为10%，培养液温度控制在37℃左右进行恒温条件下培养，CO2浓度含量控制在5%，培养箱中湿度需充分饱和。选取处在对数生长期的肠癌细胞置入经一定浓度稀释后的培养液并在培养板中接种，培养板共96孔，一孔200μL，平均每孔含癌细胞量为5×103个，注意培养液环境条件与细胞株保持一致，并将培养板分为为空白组、对照组和实验组三份。其中对空白组加入RPMI1640培养液进一步培养，对照组加入化疗药替吉奥，实验组加入化疗药联合TRAIL，三组皆继续培养20h。

1.2.2 MTT细胞毒性实验

三组培养液皆加入MTT含量为20μL后继续培养4h，培养液上清部分吸去后，加入DMSO用量200μL，震荡5min，将培养板置于酶标仪上，在电子显微镜下统计活的癌细胞数量，计算存活率，对照组癌细胞存活率=（活的癌细胞数量 / 总的癌细胞数量）×100%。重复三次，取均数。

1.2.3 Annexin V/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡

取空白组、对照组和实验组对数期细胞培养板，收集悬浮细胞：0.25%胰酶及0.02%EDTA（1∶1）收集消化贴壁细胞与悬浮细胞，离心，吸去上清培养液，预冷洗涤细胞。重新悬浮细胞，浓度控制在2 ×106/mL左右。然后取300μL细胞悬液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V/FITC和10μLPI溶液混匀。室温在避光孵育15min后，用流式细胞仪检测凋亡率，重复三次，取均数。

1.3 数据处理

本文研究所得的数据均采用SPSS17.0进行统计分析，组间差异采用t检验，差异P＜0.05具有统计学意义。

2 结 果

相对仅采取单纯化疗药治疗的对照组，实验组的肠癌细胞存活率低于对照组，而凋亡率明显高于实验组，产生差异明显，具体数据见表1。

表1 对照组和实验组抑制率和凋亡率

3 讨 论

肿瘤疾病是由于人体体内在致癌因子发生作用使癌细胞突然性大量复制增生，基因的细胞生长调控力功能消失导致病变细胞累积的一种顽症，若形成恶性的肿瘤将成为癌症[2]。目前临床上治疗肿瘤的有效方法是直接切除病灶组织和化疗，大部分患者为减少开刀痛苦一般倾向化疗治疗。但化疗药物存在严重的毒副作用以及其耐药性高，给临床资料带来了很大的困难，研究其提高其靶向性和降低耐药性是抗肿瘤方向的研究热门。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand，TRAIL）属于II 型跨膜蛋白质，是Wiley等从人心肌cDNA文库中克隆出来的。TRAIL有4种受体，死亡受体DR4、DR5， 诱捕受体DCR1、DCR2。TRAIL通过与死亡受体结合启动细胞内的信号转导，激活半胱-天冬氨酸蛋白酶（ cys-teine containing asparate specific protease，Caspase）级联反应诱导细胞凋亡，其中Caspase 8为启始Caspase。它的氨基酸含有肿瘤病变因子的结构特征，具有诱导Jurkat 细胞以及EB 病毒转化形成异样的人体淋巴细胞并促进其凋亡的能力。此外，TRAIL 还具备有通过诱导正常细胞转化成肿瘤类别细胞或病毒类别细胞并且能不断促进新生细胞凋亡，且可以发生的部位即可以在人体外也可以在人体内，速度快，数量巨大。在目前阶段已经有许多国外学者出现使用TRAIL联合顺铂或依托泊试对胶质瘤细胞进行处理的研究，结果表现出TRAIL联合顺铂或依托泊试可以增强其诱导凋亡能力[3]。国内也有学者报道了TRAIL 联合氟尿嗜咙处理结肠癌细胞联合阿霉素或者丝裂霉素处理肝癌细胞实验的研究[4]。

本文研究中，对照组采用单纯化疗药替吉奥抑制肠癌细胞，实验组采用化疗药替吉奥联合TRAIL抑制肠癌细胞，结果发现实验组的肠癌细胞存活率明显低于对照组的存活率，但在凋亡率方面明显高出实验组细胞，且产生的差异明显均具有统计学意义。此结果说明联合应用TRAIL与化疗药对抑制及诱导胃肠道肿瘤细胞凋亡具有显著的协同作用。

综上所述，化疗药联合TRAIL能有效降低抑制胃肠道肿瘤细胞的生长，促进凋亡，降低胃肠道肿瘤细胞的存活率，提高凋亡率。

[1]王宏艳,常瑛.重组可溶性TRAIL联合化疗药诱导急性白血病细胞凋亡[J].首都医科大学学报,2008,29(3):364-365.

[2]佟海侠,马力,金红丽,等. TRAIL联合化疗药物诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究[J]. 中国医科大学学报,2006,25(4):348-349.

[3]Alaimo A,Gorojod RM,Kotler ML.The extrinsic and intrinsic apoptotic pathways are involved in manganese toxicity in rat astrocytoma C6 cells[J].neurochem Int,2011,59(2):297-308.

[4]佟海侠,张继红,陆春伟,等.IFNr、TRAIL及化疗药联合诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究[J].现代肿瘤医学,2007,15(2):157-159.

R 735

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：1671-8194（2013）08-0163-02

*通讯作者：E-mail:zgz760@163.com