冯锡武，罗政委，魏 虹，农卫霞，周宗瑶

(1石河子大学医学院组织胚胎学教研室，新疆石河子832000;2石河子大学医学院附属医院)

白血病是一类造血干细胞异常的恶性克隆性疾病，骨髓移植及造血干细胞的临床应用促进了白血病及白血病干细胞(LSCs)的研究进展。自从Bonnet等［1］确认 LSCs 存在于细胞群以后，LSCs的研究进入了新的阶段［2～4］等

陆续被证实是LSCs的表型，白血病造血干细胞移植也取得了越来越显著的成就。尽管如此，造血干细

cell culture胞的体外培养扩增方面仍然面临很多困难。2011年12月～2013年2月，我们对LSCs和骨髓基质细胞共培养的方法学进行了探讨。

1 材料与方法

1．1 材料 倒置相差显微镜(OLYMPUS公司)，CO2培养箱(Thermo公司)，流式细胞仪(BD AriaIII)，超净工作台(Thermo公司)，L-DMEM培养基(Gibco公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司)，CD34-APC、CD38-FITC、CD123-PE荧光标记抗体(Ebioscience公司)，注射用丝裂霉素(浙江海正药业股份有限公司)，淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，6/24孔培养板(Corning公司)。

1．2 方法

1．2．1 骨髓单个核细胞的分离和培养 采用人淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取白血病患者骨髓单个核细胞，离心后离心管中液体明显分为4～5层:红细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞云雾状层、血浆同稀释液层(或者脂肪层)。提取单个核细胞云雾状层，离心洗涤后加入含有10%FBS的RPMI-1640中吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度106/mL，转入培养瓶或者培养板中培养。3 d后换液，将悬浮细胞分开培养或冻存。

1．2．2 饲养层细胞的制备及共培养 将第2代或第3代骨髓基质细胞……