梁欣

拉米夫定(Lamivudine，3TC)通过对反转录酶活性的抑制，能显著抑制HBV和HIV的复制，已广泛用于慢性乙型肝炎和艾滋病的治疗。用于慢性乙型肝炎治疗(100 mg/d)过程中易出现HBV DNA反转录酶区第204位氨基酸(M)的变异称为YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酶)变异。已有报道，HIV阴性的慢性乙型肝炎患者经3TC治疗后有较高的HBV YMDD变异率［1，2］。第2版国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册规定的一线 HAART方案中，3TC作为HAART方案的一部分，亦用于HIV/HBV合并感染者的治疗，3TC剂量为300 mg/d［3］。剂量的增加、联合用药以及HAART后免疫功能的重建对于HBVYMDD变异产生何种影响，国内尚少见报道。本文对进行HAART的39例HIV/HBV合并感染者进行HBV YMDD变异的监测，探讨YMDD变异的检出率及其影响因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2008年3月至2012年3月在广西钦州市第一人民医院艾滋病抗病毒治疗点治疗随访的HIV/HBV合并感染者，共39例入选。入选标准:a.AIDS及HIV感染的诊断参照2006年中华医学会颁布的《中国艾滋病诊疗指南》，所有病例经当地疾病预防控制中心蛋白印迹实验(Western blot，WB)确认HIV-1抗体阳性。b.HBV感染的诊断为抗病毒治疗前筛查HBsAg阳性，或者虽然HBsAg阴性但外周血HBV-DNA阳性。c.根据第2版国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册的一线治疗方案，接受3TC 300 mg/d作为抗反转录病毒治疗一部分，并且依从性良好、坚持治疗6个月以上，目前仍在服药或停药1月内。d.既往未使用过抗HBV治疗药物(包括3TC、阿德福韦酯、恩替卡韦、α-干扰素)。排除标准:2周内外周血HBV-DNA定量＜1.0×103IU/ml者。

1.2 HAART方案 全部患者使用第2版国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册规定的一线HAART方案，即齐多夫定(AZT)或司他夫定(d4T)+3TC+奈韦拉平(NVP)。具体用法为:含AZT方案 AZT 300 mg+3TC 150 mg+NVP 200 mg，2次/d;含d4T方案 d4T 30 mg+3TC 150 mg+NVP 200 mg，2次/d。对于NVP不能耐受或有禁忌的患者，将NVP改为依非韦伦(EFV)600 mg，1次/d;AZT、d4T 和3TC 剂量同上［3］。

1.3 观察项目 HAART前均进行CD4+细胞计数、肝功能、HBV-DNA定量、HBV血清标志物(HBV-M)定量检测。最终入选者将进行HBV基因型和HBV YMDD变异检测。

1.4 检测方法 CD4+细胞计数由当地疾病预防控制中心完成，其他检测均在我院检验科进行。肝功能检查采用日本全自动生化分析仪HITACHI7600，HBV血清标志物定量采用BIOSYS公司荧光时间分辨仪，试剂由上海科华生物工程股份有限公司提供;HBV-DNA定量采用美国Applied Biosystems公司AB 7300型基因实时荧光定量PCR仪，试剂由达安基因股份有限公司提供，HBV DNA检测下限为1.0×103IU/ml;HBV基因型和YMDD变异检测采用PCR反向点杂交法，使用杭州晶格科学仪器有限公司GeneMate热循环仪，试剂由亚能生物技术(深圳)有限公司提供，仅能定性检测我国常见的HBV-B、C、D 3种基因型和HBV抗病毒药物5个热点突变位点的6种突变类型(rt180 m、rt204 m、rt204I、rt207I、rt181A、rt236T)。

1.5 统计学方法 采用SPSS 10.0 for Windows软件分析，计量资料以平均数±标准差或中位数表示，HBVDNA定量采用求对数;两独立样本均数的比较采用t检验或Mann-Whitney检验。两样本和多样本间率的比较采用卡方检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 39例HIV/HBV合并感染者中男27例，女12例，年龄22～64(41.2±13.6)岁，可能的HIV传播途径中，性接触占30例(77%)，HAART时间为6～35(23±14)月。

2.2 HBV基因型和YMDD变异检测 39份血清标本中，检测出B基因型19例，C基因型14例，B、C混合型6例，未检出D型及其他基因型;共检出HBV YMDD变异16例，检出率41.0%。YMDD变异模式如下:rt204I占 12.5%(2/16)，rt204I+rt180 m 占 31.2%(5/16)，rt204V 占 6.3%(1/16)，rt204V+rt180 m占31.2%(5/16)，rt204I+rt204V占6.3%(1/16)，rt204I+rt204V+rt180 m占12.5%(2/16)。

2.3 HBV YMDD变异相关因素 未发现性别、年龄组、民族、可能的传播途径、基线的 CD4+细胞计数水平、基线HBeAg状态、基线HBV-DNA水平、基线ALT是否超过2倍正常值上限(ULN)、有无肝硬化或纤维化、基因型与HBV YMDD变异的发生相关(P＞0.05)。HAART时间与HBV YMDD变异相关，随着HAART时间的延长，HBV YMDD变异的检出率依次增长(P＜0.05)。详见表1。

表1 HBV YMDD变异相关因素分析()

表1 HBV YMDD变异相关因素分析()

例数n=39变异组n=16(%)未变异组n=23(%)统计值t/χ2 P值0.424 0.726女12 4(33.3) 8(66.7)年龄组(岁) ≤35 12 5(41.7) 7(58.3)35～55 20 8(40.0) 12(60.0) 0.020 0.99≥55 7 3(42.9) 4(57.1)民族 汉族 28 11(39.3) 17(60.7) 0.256 0.482少数民族 11 6(54.5) 5(45.5)可能的HIV传播途径 性接触 30 12(40.0) 18(60.0)静脉注射 7 4(57.2) 3(42.8) 2.156 0.340其他 2 0(0.0) 2(100.0)基线CD4+细胞计数(个/μl) ≤200 32 14(43.8) 18(56.2) 0.099 0.678＞200 7 2(28.6) 5(71.4)基线HBeAg状态 阳性 24 10(41.7) 14(58.3) 0.011 1.00阴性 15 6(40.0) 9(60.0)基线HBV DNA水平(log IU/ml) 6.46±3.27 6.51±3.48 6.37±3.63 0.120 0.905基线ALT水平(ULN) ≤2倍 23 9(39.1) 14(60.9) 0.083 0.515＞2倍 16 7(43.8) 9(56.2)合并肝硬化或纤维化 有 9 4(44.4) 5(55.6) 0.057 0.554无30 12(40.0) 18(60.0)HBV基因型 B型 19 8 11 C型 14 5 9 0.496 0.910 B、C 混合型 6 3 3 HAART时间(月) 6～12 10 1(10.0) 9(90.0)12～24 19 8(42.1) 11(57.9) 7.458 0.02424 ～36 10 7(70.0) 3(30.0)性别 男 27 12(44.4)15(55.6)

3 讨论

由于对HBV和HIV均具有强大的抑制作用，3TC广泛用于慢性乙型肝炎和HIV感染的治疗。Atkins M等［1］报道HIV阴性的慢性乙型肝炎患者经3TC治疗后1年、2年、3年后的HBV YMDD变异率分别为16% ～32%、47% ～56%和69% ～75%，Leung NW等［2］报道在亚洲人群中这一数据分别为15%、38%和53%。我们的研究结果显示，尽管使用了更大的剂量，在HIV/HBV合并感染患者中仍有较高的YMDD变异检出率。治疗6～12月、12～24月、24～36月后YMDD变异检出率分别为10.0%、42.1%、70.0%，与100 mg/d治疗HIV阴性的慢性乙型肝炎患者的结果类似［1］。

影响HBVYMDD变异的因素众多，各家报道不尽相同。本研究发现HIV/HBV合并感染者的HBV YMDD变异与性别、年龄、民族、HIV传播途径、基线ALT水平、HBV基因型、基线HBeAg状态、基线HBVDNA水平、有无肝硬化或纤维化、免疫状态等因素无关，与Benhamou Y等［4］的结论相似，与单独HBV感染者中的结论则不尽相同。Chang ML等［5］认为治疗前血清HBV DNA、ALT水平、HBeAg状态和治疗时间是拉米夫定治疗单独HBV感染者过程中耐药突变发生的决定因素;袁美琴等［6］则认为YMDD变异与患者性别、年龄及HBeAg状态无关，而与患者用药前ALT水平、HBV DNA含量及用药时间有关。由于本研究入组病例82.0%(32/39)为CD4+细胞200个/μl以下的HIV感染者，考虑与免疫缺陷以及合并HIV感染可能影响HBeAg表达和HBV复制有关。同时，由于HIV/HBV合并感染者的ALT水平易受免疫状态、合并感染(HCV)、合并用药等多种因素影响，ALT水平反映HBV所致的肝细胞炎症程度的意义有限。

本研究发现，随着治疗时间的延长，HIV/HBV合并感染者的HBV YMDD变异检出率显著增加(P＜0.05)，提示HIV/HBV合并感染者的HBV YMDD变异亦与治疗时间相关，与单纯HBV感染者的研究结论相一致。根据新发布的第3版国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册，HIV/HBV合并感染者的HAART方案应包含两种对HBV同样有效的核苷(酸)类反转录酶抑制剂，即包含替诺福韦(TDF)+3TC;有TDF使用禁忌的患者可在HAART基础上使用恩替卡韦、阿德福韦酯或α干扰素［7］。然而由于资源的可及性，仍有较高比例的HIV/HBV合并感染患者在使用AZT(d4T)+3TC+NVP(EFV)方案治疗。对此类患者需加强HBV DNA监测，经治疗6个月以上而没有达到病毒学完全应答的患者有条件应进行HBV YMDD变异检测，有助于治疗过程中及早发现HBV YMDD变异、调整治疗方案。

由于本研究为横断面调查，病例来源于门诊，未能获得HBV血清标志物、HBVDNA的动态变化，因此尚无法掌握含3TC的HAART后HBV YMDD变异发展的动态规律。此外，本研究所用方法仅能检测HBV抗病毒药物5个热点突变位点的6种突变类型，联合用药和HIV对HBV的影响是否会引起其他位点的突变尚有待研究。

［1］Atkins M，Hunt CM，Brown N，et al.Clinical significance of YMDD mutant hepatitis B virus in a large cohort of lamivudine treated hepatitis B patients(abstract).Hepatology，1998，28:319A.

［2］Leung NW，Lai CL，Chang TT，et al.Extended lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis enhances hepatitis B antigen seroconversion rates:Resultsafter 3 years of therapy.Hepatology，2001，33:1527-1532.

［3］中华人民共和国卫生部.国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册.第2版.北京:人民卫生出版社，2008:34-39.

［4］Benhamou Y，Boehet M，Thibault V，et al.Long-term incidence of hepatitis B virus resistance to lamivudine in human immunodeficiency virus-infected patients.Hepatology，1999，30(5):1302-1306.

［5］Chang ML，Chien RN，Yeh CT，et al.Virus and transominase levels determine the emergence of drug resistance during long-term lamivudine therapy in chronic hepatitis B.J Hepatol，2005，43(1):72-77.

［6］袁美琴，邬克奇，吴自锋.1000例慢性乙型肝炎应用拉米夫定治疗YMDD变异的综合分析.实验与检验医学，2009，27(4):347-349.

［7］本书编写组.国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册.第3版.北京:人民卫生出版社，2012:74-77.