赵 明，陈 竹，张旭乾，刘 康，冯 刚，刘丽华，韩小伟

(1.川北医学院第二临床医学院组织工程与干细胞研究所;2.南充市中心医院病理科，四川 南充 637000)

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关节软骨退行性变疾病，是一类具有高发病率和高致残率的退行性关节疾病，以骨关节炎(osteoarthritis，OA)最为常见［1］。目前尚缺乏有效的治疗方法。其主要生化改变为软骨细胞凋亡，因此探索增殖过程中的软骨细胞变化规律是研究关节软骨破坏及变性的病理及治疗的重要方面［2］。本次实验在司徒镇强［3］曾采用的软骨细胞体外培养方法基础上改进及创新，使培养方法简单易行，并观察体外培养的软骨细胞生物学特性变化，为关节软骨缺损及退行性变防治及运动医学的发展奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4 周龄新西兰乳兔(川北医学院动物中心提供)。

1.1.2 主要试剂 Ⅱ型胶原酶，胰蛋白酶(1∶250)，PBS 缓冲液(凯基生物)，胎牛血清(HYCLONE)，DMEM 培养液/高糖(HYCLONE)，青链霉素混合液(南京凯基生物)，RNA 提取试剂盒(Bioteke Corporation)，PCR 试剂盒(Fermentas)，Type Ⅱcollagen staining Kit(chondrex)。

1.2 实验方法

1.2.1 兔关节软骨细胞原代培养 取4 周龄新西兰乳兔1 只(购买于川北医学院动物实验中心)，耳缘静脉空气栓塞致死，酒精消毒，剔除双膝和双肘关节的皮肤及肌肉，浸泡于含双抗的PBS 中。在超净台上分离关节软骨面，仔细清除软骨表面滑膜，刀片削下软骨，将其剪碎成1 mm3大小碎片，PBS 冲洗3 次后，置入50 mL 离心管中，然后加入等体积胰酶，置于37 ℃恒温水浴消化，每5 min 振荡1 次，45 min 后取出，1 500 r/min 离心5 min，弃上清，加入等体积0.1%Ⅱ型胶原酶后，置于37 ℃恒温水浴消化8 h。……