林中正，谢娇枚，李基光，周 鹏，魏润洁，肖启明*

（1.湖南农业大学生物安全科学技术学院，长沙 410128；2.江苏省淮安市农业委员会，江苏 淮安 223001；3.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，长沙 410128；4.湖南省西瓜甜瓜研究所，长沙 410125）

烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的单链 RNA（ssRNA）病毒，侵染烟草后，会引起普通烟草花叶病，对烟草产区造成严重影响[1]。就目前而言，尚无理想药剂能有效预防普通烟草花叶病[2]。植物提取物抗病毒物质具有安全、有效、毒害作用低等特点，适于开发抗病毒药剂。本试验选取 24种植物材料，制备粗提物，系统测定其对TMV的抑制效果[3-4]，主要包括体外钝化 TMV作用、TMV初侵染抑制和对烟草花叶病的保护和治疗作用，为进一步开发植物源农药提供依据[5]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试烟草品种 病毒枯斑寄主为心叶烟（Nicotiana glutinosa L.），病毒系统侵染寄主为普通烟（Nicotiana tabacum L.），品种为K326，由湖南农业大学烟草基地提供。

1.1.2 供试毒源 室内供试毒源为 TMV，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供，保存于普通烟的烟叶上。

1.1.3 供试植物材料 供试植物材料购自湖南省人民医院药房等药店，部分植物材料采自湖南湘西地区，一共有 24种植物材料。据《本草纲目》及标准参考文献显示，这些植物对人或动物具有一定的抗病毒效果。

1.2 方法

1.2.1 植物粗提物的制备 新鲜的植物根、茎、叶或果实样品用烘箱 40 ℃烘干后，用中药粉碎机进行粉碎，已经晒干的中药材则直接用中药粉碎机粉碎[6]。粉碎成粉末后，用溶剂浸渍法提取植物有效成分，在室温下加入样品量的 6倍的分析甲醇（V/M），浸泡72 h，期间不断搅拌，使其充分溶解。然后用布氏漏斗过滤，再用旋转蒸发仪水浴浓缩获得提取物，提取物为膏状物，置于4 ℃冰箱保存[7]。天然植物提取物供试药剂均由提取的膏状物样品配置。

1.2.2 接种液的制备 剪取新鲜的带TMV病毒的烟叶，按一定比例加入PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2）加入500目的石英砂少许，研磨得匀浆，用4层纱布过滤掉残渣得病毒原液备用[8]。其浓度采用剪取新鲜的质量（mg）与 PBS缓冲液的体积（L）比来定义，心叶烟接种浓度为20 mg/L，普通烟接种浓度为50 mg/L。

1.2.3 植物粗提物室内生物活性测定 体外钝化作用，选取生长旺盛、健康的5～6叶期心叶烟，左半叶接种供试植物提取物与病毒液等体积混合液，右半叶接种病毒液与PBS缓冲液等体积混合液（对照），24种植物提取物的质量浓度均为1 mg/L，接种病毒浓度为20 mg/L，钝化时间分别为1 h和2 h，共48个处理，3片叶子，重复3次。采用半叶枯斑法测定，5 d后统计枯斑数，计算抑制率[9-10]。

抑制TMV初侵染试验，选取生长旺盛、健康的5～6叶期心叶烟，左半叶涂抹供试植物提取物，右半叶涂抹等体积的PBS缓冲液（对照），分两组，一组24 h后，另一组48 h后，全叶接种病毒液，24种植物提取物的质量浓度均为1 mg/L，接种病毒浓度为20 mg/L，两组，共48个处理，3片叶子，重复3次，采用半叶枯斑法测定，分别在接种病毒5 d后统计枯斑数，计算抑制率[11]。

抑制率（%）=[(对照枯斑数－处理枯斑数)/对照枯斑数]×100%

1.2.4 室内防治烟草花叶病试验 选取生长旺盛、健康的 5～6叶期普通烟 K326，采用盆栽试验，测定植物提取物对烟草花叶病的药效，试验分两种方式，即保护组（喷洒植物提取物3次后，接种病毒液）和治疗组（接种病毒液后，植物提取物3次），此外还设空白（CK）对照组（只接种病毒液，不喷洒植物提取物）。采用喷雾法，每5 d喷洒植物提取物一次，共3次，保护组最后1次喷洒植物提取物后接种 TMV；治疗组在第 1次喷洒植物提取物前接种TMV。均在接种病毒液后的14 d和21 d调查发病情况，并计算病情指数和防治效果。每个样20株苗，重复3次，病害分级标准参照烟草花叶病分级标准[12-13]。病情指数=∑（病级数×病株数）/（最高病级×各处理总株数）×100；防治效果（%）=（对照病指－处理病指）/对照病指×100%。

以上试验于2011年7月1日至9月5日在湖南农业大学生物防治实验室完成。

2 结 果

2.1 植物提取物对TMV的体外钝化作用

采用半叶枯斑法测定，植物提取物对TMV的体外钝化作用，结果见表1。

从表1可以看出，24种植物的提取物对TMV均表现一定的钝化作用，但钝化效果有明显的差别，其中银杏、栀子、商陆、赤芍表现的钝化作用较强，在体外钝化2 h的抑制率均在80%以上。提取物对TMV的钝化效果表现为时间效应，随着钝化作用时间的延长，对TMV的抑制效果也逐渐增强，如效果比较好的银杏，在钝化1、2 h后，抑制率分别为89.65%、90.31%。

2.2 植物提取物对TMV的初侵染抑制作用

采用半叶枯斑法测定，植物提取物对TMV的初侵染抑制作用，详见表2。

表1 植物提取物对TMV的体外钝化作用Table1 Inactivation of plant extracts to TMV

表2 植物提取物对TMV初侵染抑制作用Table2 Inhibiting infectivity of plant extracts to TMV

从表2可以看出，24种植物的提取物均表现出了对TMV的初侵染抑制作用，但抑制效果有明显差别，且同一植物提取物涂抹后24 h和48 h接种病毒的抑制作用较为接近，时间效应不明显。与体外钝化效果相比，同一植物提取物对TMV的初侵染抑制作用较体外钝化的抑制效果总体上来说会略微弱一点，比如银杏提取物对TMV的初侵染抑制作用，24 h和48 h后接种病毒液，抑制率分别为80.21%、82.33%，比体外钝化2 h的抑制率（90.31%）微低。

2.3 室内防治烟草花叶病试验

植物提取物对烟草花叶病的保护作用，结果见表3。

表3 植物提取物对烟草花叶病的保护作用Table3 Protection effect of plant extracts on TMV

从表3可以看出，植物提取物对烟草花叶病均有一定的保护作用，其中，商陆和栀子表现的保护作用较明显，在接种病毒液14 d后，防治效果分别达到75.23%、74.33%。病情指数和防治效果都存在时间效应，随时间的递增病情指数上升，防治效果下降。

植物提取物对烟草花叶病的治疗作用，结果见表4。

表4 植物提物对烟草花叶病的治疗作用Table4 Remedial effect of plant extracts on TMV disease

从表4可以看出，植物提取物对烟草花叶病有一定的治疗作用，防治效果明显好于保护作用。其中，喷洒银杏提取物的烟草植株在接种病毒液14 d后的治疗效果可达93.59%。

3 讨 论

本试验研究表明，供试的 24种植物提取物对TMV均具有一定的钝化作用，对TMV初侵染抑制效果略差。其中以银杏、栀子、商陆、赤芍等植物提取物的效果较好，其体外钝化效果明显高于TMV初侵染的抑制作用。室内盆栽试验也表明，以银杏、栀子、商陆、赤芍等植物提取物对烟草花叶病的保护和治疗效果比较明显。从本试验结果可以看出，银杏、栀子、商陆、赤芍等提取物对烟草花叶病毒（TMV）具有明显的抑制作用。

面对日趋严重的烟草花叶病带来的危害，抗病毒药剂的研发面临新挑战，从目前发展情况来看，运用基因工程技术开发转基因抗病品种、弱毒疫苗等仍不成熟，且存在一定争议。而传统的抗病毒制剂往往对植物有毒害、高副作用。植物提取物抗病毒的效果已经大部分研究证实，植物提取物治疗效果不亚于化学合成制剂，一般不会造成环境污染和残留毒性问题，具有广阔的发展前景[14]。如果能在研究单一植物提取物对烟草花叶病毒（TMV）抑制作用的基础上，深入分析其抗病毒有效成分，并运用中药复方理论，对效果较好的植物提取物按比例进行复配，开发出更稳定、高效、可供农业生产上实际应用的植物源农药，那其应用前景就更广阔，使用价值就更加巨大。

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