金 宏 齐 玲 刘 威 袁 瑞 温 娜 于洪泉 (吉林医药学院实验中心，吉林 吉林 3203)

五味子是一种较常见的普通中药材，属木兰科多年生落叶，木质藤本植物，五味子作为药材，最早收载于《神农本草经》中被列为上品。现代药理研究表明，五味子含有多种营养成分，如五味子素、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、脂肪油、挥发油、糖类、树脂、维生素C等，还含有钨、铁、锰、锌、磷等微量元素，是非常有益的健康食品及药物，常用于神经系统疾病和心血管疾病的治疗。本研究探讨五味子木脂素对体外培养的脑神经细胞的毒性作用及对大鼠脑胶质瘤细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 细胞培养基DMEM、RPMI1640、二甲基亚砜(DMSO)(Thermo公司)，小牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)，五味子木脂素(北华大学提供)，四甲基偶氮唑(MTT)(Sigma公司)。

1.2 小鼠原代神经细胞的提取〔1〕取1月龄小鼠，将其断颈处死，75%酒精消毒，剪断颈部取出脑组织，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2遍，用组织剪将脑组织剪成1 mm×1 mm大小，置于15 ml离心管中，加入胰蛋白酶，37℃水浴消化30 min，加小牛血清终止消化，离心，弃上清，加培养液反复吹打，70 nm滤膜过滤，离心，弃上清，加含10%小牛血清的DMEM培养液，接种于25 mm培养瓶中，每天观察生长情况。

1.3 大鼠脑胶质瘤C6细胞的培养 从液氮中取出冻存的大鼠脑胶质瘤C6细胞，迅速放入37℃水浴箱中复苏，然后将细胞接种于培养瓶中，加入10 ml含10%小牛血清的RPMI1640细胞培养液，置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，隔日换液。

1.4 药物作用细胞生长情况 取等量五味子木脂素分别加入含5%小牛血清的DMEM和RPMI1640细胞培养液，配制成终浓度为0、50、100、200μg/ml的药物。取对数生长期的神经细胞和脑胶质瘤C6细胞，用胰酶消化后，分别加入相应的细胞培养液调整细胞浓度为8×103/ml。将细胞悬液分别均匀接种于96孔板中，每孔100μl，置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，使细胞同步。弃去上清液，加入含不同浓度的五味子木脂素，每个药物浓度重复3次，继续培养48 h。药物作用结束时，每孔加入MTT 20μl，37℃继续孵育4 h，终止细胞培养，弃去上清液，每孔分别加DMSO 150μl，震荡均匀使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶联免疫检测仪上490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值，用不加细胞的空白孔调零。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，实验结果以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD、DUNCAN法和t检验。

2 结果

药物作用48 h，随药物浓度的增加对神经细胞生长无明显抑制作用，细胞在50μg/ml和100μg/ml时仍保持增殖趋势，说明该药在200μg/ml浓度内对细胞无明显毒副作用。药物作用胶质瘤细胞48 h后，随着药物浓度增加，对细胞开始呈现明显的抑制作用，尤其是药物浓度超过100μg/ml时，抑制作用尤为明显(P＜0.01)，说明该药对胶质瘤细胞有明显抑制作用，并且与药物浓度呈正相关。见表1。

表1 五味子木脂素对神经细胞及胶质瘤细胞的作用(x ± s，n=3)

3 讨论

近些年来，寻找低毒高效的抗肿瘤药物成为研究的热点问题之一。本实验结果表明，五味子木脂素浓度在200μg/ml以内对正常脑神经细胞无明显毒副作用，药物作用后细胞仍保持增殖能力，药物不抑制正常神经细胞的生长。这一结论在国内外鲜有报道〔2〕。本实验结果显示了中药五味子具有毒性小的特点。

五味子木脂素体外抑瘤实验表明，药物浓度在200μg/ml以内随药物浓度的增加对肿瘤细胞的抑制率增强，说明该药对胶质瘤细胞具有显著的抑制作用，这一结论与本课题组之前的研究结果一致。同时也与一些学者〔3～5〕研究结论相似。迄今为止，研究表明五味子木脂素抑制肿瘤的具体途径有很多种，如发挥其抗氧化作用抗肿瘤〔6〕，通过多种方式诱导肿瘤细胞发生凋亡〔7〕，抑制肿瘤内血管的生成而实现抗肿瘤目的〔8〕，通过抑制癌基因起到抗肿瘤作用〔9〕，作为分子靶向药物的新靶点起到抗肿瘤作用〔10〕等，那么五味子对脑胶质瘤细胞是通过什么方式来发挥其抑瘤作用，目前还不清楚，有待于进一步研究。

1 Galli R，Gritti A，Vescovi AL.Adult neural stem cells〔J〕.Met Mol Biol，2008;438:67-84.

2 苗明三.五味子多糖对衰老模型小鼠的影响〔J〕.中国医药学报，2002;17(3):187-8.

3 顾 颖，李 凌.五昧子乙素促进多柔比星诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡的研究〔J〕.实用肿瘤杂志，2006;2(5):412-6.

4 Wu YF，Cao MF，Gao YP，et al.Down-modulation of heat shock protein 70 and up-modulation of Caspase-3 during schisandrin B-induced apoptosis in human hepatoma SMMC-7721 cells〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10(20):2944-8.

5 吕冬霞，崔 健，刘月霞，等.五味子乙素联合顺铂诱导H22肝癌移植瘤细胞凋亡过程中caspase-3，8，9表达的研究〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(4):416-8.

6 Chiu PY，Lam PY，Yan CW，et al.Schisandrin B protects against solar irradiation-induced oxidative injury in BJ human fibroblasts〔J〕.Fitoterapia，2011;82(4):682-91.

7 刘晓霓，金秀东，张承玉，等.复方五味子素B抑制人胃癌细胞株增殖的机制研究〔J〕.中药新药与临床药理，2008;19(4):262-5.

8 迟德彪.五味子乙素对人神经胶质瘤血管内皮细胞生长因子表达的影响〔D〕.广州:南方医科大学博士论文，2008:4.

9 李先伟，杨解人.五味子乙素抗H2O2诱导PC12细胞凋亡的机制〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(12):2244-7.

10 牟遇霖.五味子抗肿瘤的研究现状〔J〕.中国医药导报，2010;7(2):84-5.