钟小明 胡侦明 沈皆亮 甘 强 郝 杰 (重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 40006)

椎间盘退变时，终板退变导致的使髓核营养供应减少及代谢产物排出减少，是促进髓核退变的重要因素。白藜芦醇(RES)是广泛存在于葡萄酒、水果、中药中的一种植物抗毒素和抗氧化剂，大量研究表明RES可以活化各种生物体内的沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)从而使SIRTl发挥保护机体、抵抗各种应激及炎症反应的作用，是目前发现的最好的天然SIRTl激活剂。目前，尚缺乏RES对退变椎间盘细胞抗凋亡及抑制退变方面的研究。本研究探讨白藜芦醇干预对退变椎间盘终板软骨细胞SIRT1表达的浓度、时间量效关系，为进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 RES(Sigma，USA)用二甲亚砜(DMSO)配制成0.2 mol/L母液备用，使用之前用含20%胎牛血清的F12-DMEM培养液稀释成不同浓度的工作液，DMSO终浓度不高0.1%。F12-DMEM培养基(HyClone，USA)，Ⅱ型胶原酶(Sigma，USA)，胰蛋白酶 (Hyclone，USA)，胎牛血清 (Hyclone，USA)，SIRT 一抗(Abcam，USA)，COLA2α1 一抗、aggreean 一抗(Santa Cruz，USA);HRP 标记二抗(GenScript，USA);总 RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(闪晶公司，上海)。JY300C电游仪(北京君意)，UVP GDS8000凝胶成像系统(UVP，USA);FTC3000 real-time PCR 仪(Funglyn Biotech，Canada)。

1.2 方法

1.2.1 人退变椎间盘终板软骨细胞的分离与培养 退变椎间盘终板软骨细胞获取自老年腰椎间盘突出症患者手术时刮除的软骨终板，共6例，年龄64～72岁，平均年龄67.8岁，男3例，女3例;均经术前MRI及术后病理检查诊断为“椎间盘退变”。手术时取得的软骨终板标本，刀片刮除髓核及纤维环，剪碎至约1 mm3;PBS液冲洗2遍，离心(200 r/min，3 min)后加入约7～8倍体积的0.25%的胰蛋白酶液，37℃消化15 min，加入2～3 ml含20%FBS的 F12-DMEM培养基终止消化;离心(800 r/min，5 min)，弃上清液，PBS液冲洗2遍，加入含10%胎牛血清的0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃下搅拌消化4 h;200目细胞筛过滤，离心(800 r/min，5 min)，去除上清液，取细胞沉淀，加入含20%胎牛血清的F12-DMEM培养基，吹打细胞，镜下计数，按2×104/ml密度种植于50 ml培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每3天换液1次，隔天用倒置显微镜观察、拍照;细胞融合率90%左右时传代，亦按2×104/ml密度接种。

1.2.2 细胞分组与处理 P2代细胞培养至融合度90%左右时随机分组，分别进行如下处理:①空白对照组:不加入RES及DMSO，只加入培养基 。②溶剂对照组:加入0.1%DMSO(相当于作为RES溶剂时的最高浓度);③RES干预组:设置为12.5、25、50、100 μmol/L 等 4 个浓度，分别作用 12、24、48 h。培养中止后收集细胞，进行测定。

1.2.3 细胞形态学观察及免疫细胞化学染色鉴定 荧光倒置相差显微镜下观察细胞的形态并拍照。处理后48 h的P2代终板软骨细胞行细胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，3%过氧化氢室温孵育10 min;蒸馏水冲洗，PBS浸洗(5 min×3次);5%封闭血清封闭15 min;倾去血清，SIRT1一抗(按说明书稀释)4℃过夜;PBS冲洗(5 min×3次);滴加生物素标记二抗，37℃孵育20 min;PBS冲洗(5 min×3次);滴加亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)，37℃孵育20 min;PBS冲洗(5 min×3次);DAB显色试剂盒显色(镜下掌握显色程度);自来水冲洗，苏木素复染约30 s，自来水洗 30 min，树脂封片。阴性对照以一抗稀释液代替一抗。

1.2.4 Western印迹检测SIRT1蛋白表达水平 弃去培养基，冷PBS漂洗3次;6孔板置于冰面，每孔加入0.5 ml冷RIPA裂解液，用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，冰面晃动裂解30 min;4℃离心(12 000 r/min，10 min)，收集上清液即为蛋白质粗提物。BCA法测定蛋白质浓度。上样前稀释至相同浓度。等量上样进行SDS-PAGE电泳，电转至 PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，SIRT1一抗4℃孵育过夜，TBST冲洗3次，每次 10 min;HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL显色，曝光，UVPGDS8000凝胶成像系统分析条带的灰度值。以GAPDH做内参。

1.2.5 荧光定量PCR检测SIRT1 mRNA表达水平 按照试剂盒说明书的操作步骤进行总RNA提取及鉴定。SIRT1引物序列正义链5'-CAAAGGAGCAGATTAGTAGGCG-3'，反义链 5'-CTCTGGCATGTCCCACTATCAC-3'。内参 β-actin引物序列:正义链5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反义链 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。配置PCR反应体系(2×Premix 25μl，25 pmol/μl引物 1 μl×2，Sybr green I 0.5 μl，模板 cDNA 2 μl，DEPC水0.5μl)，总体积301μl。FTC-3000实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应并自动分析，条件如下:94℃ 预变性4 min，然后依次以“94℃ 变性20 s、60℃ 退火30 s、72℃ 延伸30 s”循环，共扩增循环35次，72℃检测信号。以β-actin做内参。

2 结果

2.1 细胞形态学观察及免疫组化染色鉴定 原代细胞3 d左右后开始逐渐贴壁，约7～9 d贴壁完全，细胞呈类圆形，轮廓清楚，细胞核呈圆形。10～12 d时细胞融合，连接成片，细胞融合率约80%～90%时适宜传代。传代后，细胞于24 h后贴壁完全，于1 w左右细胞单层融合，逐渐变为长梭形。细胞传至第2、3代时，细胞的形状仍然保持为长梭形，至第4代时细胞已有部分呈现不规则多角形改变，呈铺路石状，胞体体积变小，生长变慢。COLA2α1和Aggrecan的免疫组织化学染色均可见阳性表达，胞质呈棕黄色，而胞核未见染色，符合终板软骨细胞的特点，见图1。

图1 细胞形态学观察及免疫组化染色鉴定

2.2 RES干预对SIRT1蛋白表达的影响 采用Western印迹法检测各样本SIRTl蛋白表达的变化(图2)。经RES干预后，各组SIRT1蛋白表达均不同程度增加(图3)。与空白组相比较，浓度在12.5μmol/L、作用24 h，以及浓度在50μmol/L、作用12 h以上方有统计学差异(P＜0.05);与空白对照组相比，DMSO组SIRT1蛋白表达差异无显著性(P＞0.05)，提示0.1%DMSO对细胞表达SIRT1蛋白无抑制作用。在对浓度的组间比较中，统计结果显示浓度在50μmol/L以上时，RES明显促进SIRTl蛋白表达，在该浓度范围内组间比较结果都有统计学意义(P＜0.05)。在对作用时间的组间比较中，统计结果显示，浓度在25μmol/L以上时，随时间增加而SIRT1蛋白表达增加，组间比较均有统计学意义(P＜0.05)。因此，可认为 RES对终板软骨细胞细胞SIRT1蛋白表达的促进增殖作用呈明显的剂量、时间依赖。见图3。

图2 Western印迹检测各样本SIRTI蛋白表达

2.3 RES对 SIRT1 mRNA表达的影响 采用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各样本SIRT1 mRNA表达的变化。结果表明，经不同浓度白藜芦醇处理12、24、48 h后(图4)，终板软骨细胞细胞SIRT1 mRNA表达组间比较差异有显著性(P＜0.05)。与空白组相比较，作用12 h时任何浓度SIRT1 mRNA表达均无显著性差异(P＜0.05);浓度在12.5μmol/L、作用48 h，以及浓度在50μmol/L、作用24 h以上方有统计学差异(P＜0.05);与空白对照组相比，DMSO组SIRT1蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)，提示0.1%DMSO对细胞表达SIRT1蛋白无抑制作用。在对浓度的组间比较中，统计结果显示浓度在50μmol/L以上时，RES明显促进SIRTl蛋白表达，在该浓度范围内组间比较结果都有统计学意义(P＜0.05)。在对作用时间的组间比较中，统计结果显示，浓度在25μmol/L以上时，随时间增加而SIRT1蛋白表达增加，组间比较均有统计学意义(P＜0.05)。因此，可认为RES对DEC细胞SIRT1蛋白表达的促进增殖作用呈明显的剂量、时间依赖。

图4 白藜芦醇对DEC细胞表达SIRT1 mRNA 的影响(2－△△Ct分析法)

3 讨论

现已公认椎间盘退变是引起脊柱退行性疾病的主要原因，但引起椎间盘退变的确切机制目前尚不清楚。已有研究表明〔1，2〕，椎间盘是人体最大的缺氧组织，终板软骨退变，软骨下椎体骨质增生钙化，导致弥散功能降低，阻碍了髓核获得所需营养物质，同时抑制代谢废物的排泄，加速并促进了椎间盘的退变。因此，终板软骨细胞的退变在椎间盘退变的病理过程中发挥了至关重要的作用。

终板软骨退变既包括软骨细胞凋亡，也包括细胞外基质合成障碍与降解加速导致的软骨终板功能障碍。软骨细胞在未失去其表型的状态下，主要分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原是关节软骨的重要组成成分，对维持关节软骨的生理功能具有重要作用。实验证实，退变腰椎终板软骨细胞合成Ⅱ型胶原能力下降〔3〕。因此，Ⅱ型胶原及Aggrecan代谢改变和信息调控是研究软骨基质代谢障碍的关键靶点。

实验证实，SIRT1是哺乳动物延缓衰老、延长寿命的关键分子，在细胞周期、代谢、分化等方面发挥广泛调节作用〔4，5〕。Dvir-Ginzberg等〔6〕证实人关节软骨细胞的SIRT1高表达能够促进软骨特异性细胞外基质基因〔Aggrecan，collagen 2a(α1)and 2b(α1)，collagen 9(α1)〕的表达。Gagarina等〔7〕证实骨性关节炎患者SIRT1可抑制软骨细胞凋亡。但目前尚无关于SIRT1在人终板软骨细胞是否发挥类似抑制退变及凋亡作用的报道。

RES是一种蒽醌萜类化合物，天然RES广泛存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物中，被认为具有SIRT1酶活性激动剂的作用，但其具体机制尚有争议。Borra等〔8〕认为RES与SIRT1共价结合，导致后者空间构象改变，底物的亲和力提高。但最近亦有研究者〔9〕对这一观点提出反对意见，认为RES并非直接作用于SIRT1从而提高其酶活性。

本文的结果表明，合适剂量及作用时间的RES能够上调退变椎间盘软骨终板细胞SIRT1 mRNA的表达水平，并且增加SIRT1蛋白的合成，提示RES能够在转染水平上调SIRT1基因表达，增加细胞内SIRT酶蛋白含量，这亦是RES增加SIRT1体内催化活性的可能途径之一。

本实验虽然证实RES刺激SIRT1 mRNA表达，但尚缺乏二者(RES和SIRT1)在蛋白水平表达相关性的依据，因为复杂的转录后和翻译水平调控机制仍可影响其蛋白质的合成。为了进一步研究，选择合适的时间和浓度进一步研究RES对SIRT1和SIRT1 mRNA蛋白表达的影响成为必要。既往研究表明〔10～12〕，RES在多种肿瘤细胞的抑制生长、促进凋亡作用呈现浓度依赖特性，我们的前期试验表明，RES在退变椎间盘细胞能够发挥抑制凋亡、促进细胞外基质合成的作用，该作用与RES在肿瘤细胞促进凋亡的作用恰恰相反，因此，此种作用是否亦呈现浓度及时间依赖性，以及合适的剂量、时间如何，目前尚缺乏类似研究。因此，本研究探讨了不同浓度及时间的RES对退变椎间盘终板软骨细胞表达SIRT1的影响，为进一步研究提供合适的白藜芦醇浓度及作用时间。本研究发现，在一定剂量及作用时间范围内(浓度在12.5μmol/L、作用24 h，以及浓度在50μmol/L、作用12 h以上)，RES能够显著促进已退变椎间盘终板软骨细胞表达SIRT1蛋白及SIRT1 mRNA，且该作用呈明显的剂量、时间依赖性。

1 Gruber HE，Gordon B，Williams C，et al.Vertebral endplate and disc changes in the aging sand rat lumbar spine:cross-sectional analyses of a large male and female population〔J〕.Spine，2007;32(23):2529-36.

2 Peng BG，Hou SX，Shi Q，et al.The relationship between cartilage endplate calcification and disc degeneration:an experimental study〔J〕.Chin Med J，2001;114(3):308-12.

3 王 飞，江建明，王凤龙，等.退变腰椎软骨终板细胞生物学特征实验研究〔J〕.南方医科大学学报，2010;30(4):871-74.

4 Hou X，Xu S，Maitland-Toolan KA，et al.SIRT1 regulates hepatocyte lipid metabolism through activating AMP-activated protein kinase〔J〕.J Biol Chem，2008;283(29):20015-26.

5 Tang BL.SIRT1，neuronal cell survival and the insulin/IGF-1 aging paradox〔J〕.Neurobiol Aging，2006;27(3):501-5.

6 Dvir-Ginzberg M，Gagarina V，Lee EJ，et al.Regulation of cartilage-specific gene expression in human chondrocytes by SirT1 and nicotinamide phosphoribosyltransferase〔J〕.JBiol Chem，2008;283(52):36300-10.

7 Gagarina V，Gabay O，Dvir-Ginzberg M，et al.SirT1 enhances survival of human osteoarthritic chondrocytes by repressing protein tyrosine phosphatase 1B and activating the insulin-like growth factor receptor pathway〔J〕.Arthritis Rheum，2010;62(5):1383-92.

8 Borra MT，Smith BC，Denu JM.Mechanism of human SIRT1 activation by resveratrol〔J〕.J Biol Chem，2005;280(17):17187-95.

9 Pacholec M，Bleasdale JE，Chrunyk B，et al.SRT1720，SRT2183，SRT1460，and resveratrol are not direct activators of SIRT1〔J〕.J Biol Chem，2010;285(11):8340-51.

10 Marier JF，Chen K，Prince P，et al.Production of ex vivo lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha，interleukin-1beta，and interleukin-6 is suppressed by trans-resveratrol in a concentration-dependent manner〔J〕.Can JVet Res，2005;69(2):151-4.

11 Wang Y，Leung LK.Pharmacological concentration of resveratrol suppresses aromatase in JEG-3 cells〔J〕.Toxicol Lett，2007;173(3):175-80.

12 王广秀，浦佩玉，康春生，等.白藜芦醇对C6鼠胶质瘤细胞抑制生长和诱导凋亡的作用〔J〕.中华神经外科杂志，2007;23(4):3.