高 雪 杨 镛(昆明市第一人民医院干疗科，云南 昆明 650000)

缺氧诱导因子(HIF)-1α与同源盒(gax)基因是参与血管内皮细胞(VEC)和血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的主要相关基因〔1〕。VEC与VSMC连接结构是二者之间相互传递信息的重要通路〔2〕。本研究探讨 HIF-1α与gax基因表达水平对VECVSMC细胞连接生成的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 Wistar大鼠20只，雌雄不拘，体重(250±40)g，由中国医科大学实验动物部提供。随机分为对照组和实验组，每组10只。

1.2 动物模型制作及标本收集 两组实验动物均行自体静脉移植术。10%水合氯醛腹腔麻醉，切取4 mm大鼠右颈内静脉，其中，实验组切取下的静脉置于高滴度的含有HIF-1αcDNA的重组腺伴随病毒(rAAV)工作液中(rAVV-HIF-1α为2×1011v.g/ml)，0～4℃下体外孵育45 min;而对照组切取的静脉仅用空载rAAV工作液处理，0～4℃下体外孵育45 min，两组切取的静脉均与对侧颈总动脉端端吻合，术后分笼标记统一饲养。术后14 d时，在麻醉下切取大鼠移植静脉。每组动物分别随机选择6只大鼠的移植血管，即刻置于液氮，于-70℃冰箱中保存，用于RT-PCR;4只大鼠移植血管置2.5%戊二醛中固定，4℃保存，用于电镜观察。

1.3 RT-PCR 总RNA提取(Trizole液，Sangon)，紫外分光光度计(A260/A280)检测RNA纯度。总RNA 1μl，逆转录反应体积20μl(美国Promega公司产品)，逆转录合成的cDNA于-20℃下保存。HIF-1α 引物设计参照文献〔3〕，HIF-1α(568 bp，上海生物工程公司)上游引物5'-TGAGGCTCACCATCAGTTAT-3'，下游引物 5'-TAACCCCATGTATTTGTTC-3'，β-actin 为内参照，上游引物 5'-ATTGTAACCAACTGGGACG-3'，下游引物5'-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3'，扩增产物640 bp。PCR扩增体系50 μl。扩增条件为 94℃ 2 min，1 个循环;95℃ 15 s，55℃30 s，72℃ 30 s，28个循环，接 72℃后延伸 5 min。采用自动电泳凝胶成像分析仪(Chem Imager 5500，USA)及分子分析软件进行图像扫描和分析。HIF-1α积分灰度值/β-actin积分灰度值，所得值为HIF-1αmRNA相对表达值。gax引物由中国医科大学分子遗传学研究室设计，上游引物:5'-CCCGCGCGGCTTTTACATTAGGAGT-3'，下游引物:5'-GCTGGCAAACATGCCCTCCTCATTG-3'(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，扩增产物片段为300 bp。

1.4 Western印迹检测HIF-1α和gax蛋白表达 HIF-1α和gax单克隆抗体(BOSTER生物工程公司提供)。操作均按说明书进行。

1.5 透射电镜观察 移植静脉5～6块，每块1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm，2.5%戊二醛前固定，缓冲液漂洗，1%锇酸后固定，30%、50%和70%酒精及80%、90%和100%丙酮逐级脱水，浸透包埋，聚合，修块，LKB-V型超薄切片机制作超薄切片(50～70 nm/片)，以醋酸双氧铀与柠檬酸铅双重染法行电子染色，H-600型透射电镜(HITACHI，Japan)观察VSMC超微结构。连续计数 200个 VSMC，其中合成型 VSMC与收缩型VSMC数量用百分比表示。

2 结果

2.1 二组HIF-1α和gax mRNA和蛋白表达水平 静脉移植术后14 d，在568 bp处可见两条HIF-1αmRNA的RT-PCR表达产物。实验组HIF-1αmRNA表达明显高于对照组(P均＜0.01)。见表 1，图 1，图 2。

2.2 两组大鼠移植静脉透射电镜观察结果 移植静脉术后14 d，对照组中少见增生的VEC-VSMC细胞连接的超微结构，VSMC排列欠规整。实验组中VEC增生显著，VSMC排列较规整，VEC-VSMC细胞连接重建显著，中间型(又称为过渡型)和收缩表型VSMC居多(P均＜0.01)。见表2，图3。

表1 两组HIF-1α和gax mRNA和蛋白表达水平(x ± s，n=6)

表2 移植静脉VSMC增殖状态检测结果(x ± s，n=4)

图1 两组HIF-1α和gax mRNA RT-PCR表达产物

图2 两组HIF-1α、gax蛋白免疫印迹杂交结果

图3 术后14 d实验组移植静脉超微结构(×6 000)

3 讨论

对血管组织中的VEC-VSMC细胞连接的认识大约经历了三个时期:二十世纪80年代中期提出肌内皮连接结构的概念;继之于90年代中期证明VEC与VSMC之间通过各自胞浆突出延伸可形成一种可传递信息的连接结构;二十一世纪初期通过部分学者对这一连接结构的诸多描述而逐渐将这一结构定性和定量化。所谓VEC-VSMC细胞连接是指在显微镜下观察到血管组织中VSMC与VEC之间有突起的胞浆，该VSMC胞浆穿过内弹力板上的许多小孔到达VEC并与VEC胞浆结合，形成一种厚约15 nm的间隙连接，这种连接可允许分子量小于1 000的水溶性分子通过，使VSMC能有效接受VEC产生的第二信息，从而对VSMC本身的收缩表型状态起到稳定作用。因此也将VEC-VSMC细胞连接称之为肌-内皮连接耦系统。在血管外科领域，所关心的是在活体组织中，如果这一耦联系统受损，近内侧弹力膜处VSMC是否可自收缩表型转变为合成表型状态，因为合成表型VSMC是参与并导致血管内膜的过度增生(IH)从而引起血管腔狭窄主要细胞。从本研究所采用的静脉移植动物模型中通过电镜观察到，移植静脉中肌内皮连接结构因人为造成的对血管的牵拉和血管自身的缺血缺氧等因素的作用，VEC与VSMC之间的连接消失。并且，VEC受损或脱落，合成表型VSMC较收缩表型VSMC相对增多。肉眼条件下即可观察到移植静脉管腔显著狭窄。因此推测出肌内皮连接耦联系统应是影响VSMC表型转化态的重要结构之一。就移植静脉而言，在移植早期重塑这一结构，对VSMC收缩表型的稳定或合成型的转态应能发挥重要的生物效应。本研究在基因转染的移植静脉早期，有VEC-VSMC细胞连接形成。这一研究结果表明，VEC-VSMC细胞连接这一信息通路是稳定移植静脉重塑早期VSMC转化态重要的组织结构之一。

1 温进坤，石 缨.血管平滑肌细胞增殖调控机理的研究进展〔J〕.物理学进展，1996;27(2):149-52.

2 SongW.Phecotypic changes of vascular smooth muscle cells and their fuction significance〔J〕.Med Invest Communi，1993;22(4):10-3.

3 Saito Y.Mechanism of phenotypic formation of smooth muscle cells〔J〕.Ann N Y Acad Sci，1995;748(1):7-10.

4 Kocher O，Gabbiani G，Reidy MA，et al.Phenotypic feature of smooth muscle cells during the evolution of experimental carotide artery intimal thickening.Biochemical and morphological studies〔J〕.Lab Invest，1991;65(4):459-70.