卢黄华，丁玉琴，覃世民，曾端辉

(1.湖南省粮油科学研究设计院，湖南长沙410201;2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004)

我国是世界第一渔业大国，随着人们生活水平的提高，低值鱼类直接食用的价值越来越低。目前，低值鱼深加工仍是个薄弱环节，精加工尚处于起步待开发阶段［1］。鱼类资源蛋白质品质高，吸收利用率高，有着巨大的开发潜力，是满足人类蛋白质需求的良好资源［2］。鱼蛋白经酶水解后，降解为易被人体吸收的可溶性蛋白、短肽和L-氨基酸［3］。研究表明，短肽比氨基酸具有更高的吸收速度，营养及生理功能更好［4］，具有降血脂［5］、抗氧化［6］、降血压［7］、增强免疫［8］等生理功能，已经成为了鱼类蛋白质制品的主要发展方向［9］。近年来，利用酶水解鱼类蛋白制取可溶性蛋白制品进行低值蛋白源高值化利用的研究已有报道［10-11］。国外对鱼蛋白水解产物的利用主要集中在将海洋低值鱼蛋白酶解制备生物活性肽，研究与开发海洋保健食品和药物，而国内对鱼蛋白水解的研究主要着重于如何从鱼下脚料中回收蛋白质成分［12］，对低值淡水鱼蛋白水解成短肽的研究甚少。白鲢是我国主要的低值淡水鱼之一，鱼肉蛋白质含量高，各种必需氨基酸含量均优于或接近WHO模式［13］，是一种优质蛋白。本研究拟采用蛋白酶水解白鲢鱼肉，研究对酶解产物的氮收率、水解度、平均肽链长度的影响，筛选出合适的蛋白酶，为生产鱼蛋白酶解短肽提供可借鉴的工艺条件，探索低值白鲢深加工的出路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白鲢Silver Carp 购自华中农业大学菜市场;碱性蛋白酶、胰蛋白酶 诺维信天津公司;风味蛋白酶 北京迪拜尔生物公司;其他试剂均为国产分析纯。

722S可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;DHG-9240A电热干燥箱 上海市精宏实验设备有限公司;TDL-80-ZB型离心机 上海安亭科学仪器厂;818型pH计 美国奥立龙公司;BS-210分析天平 德国赛多利斯公司;AUW220电子天平日本岛津公司;K600食物调理机 德国博朗电器公司;HH-6型数显恒温水浴锅、SK-1快速混匀器、SHA-C恒温振荡器 常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼肉前处理 新鲜白鲢去头、尾、内脏，剥皮，清洗干净后采肉，然后用食物调理机将其捣碎成均匀的糜状，最后用12cm×8cm PE自封袋分装置于-18℃冰箱冻藏备用［7］。

1.2.2 蛋白酶的筛选 取自然解冻后的鱼糜15.00g，选取碱性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶，参考武贤壮［14］等实验条件，选择温度分别为 55、50、45℃，料水比为1∶4，加入4mol/L HCl或NaOH分别达到pH7.5、6.5、8.0，保温10min后，均加入3000U/g酶于恒温振荡器中进行酶解，每隔30min滴加4mol/L NaOH以维持pH。酶解3h后，沸水浴10min使酶失活，迅速冷却后于4000r/min离心10min，收集上清液，计算氮收率、水解度和平均肽链长度以确定最佳用酶。

1.2.3 酶解条件的优化 在选酶实验的基础上，以温度、加酶量、起始pH和料液比为实验因素，以氮收率、水解度和平均肽链长度为指标，采用L9(34)正交实验对最佳用酶解条件进行优化，实验方案如表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 粗蛋白含量测定 原料总氮及水解液中总氮均采用微量凯氏定氮法(GB5009.5-85)。

1.2.5 游离氨基态氮的测定 采用茚三酮比色法［14］。

1.2.6 蛋白酶活力的测定 福林酚法，参考李艳丽等的实验方法［15］。

1.2.7 氮收率 、水解度及平均肽链长度的计算 按公式进行计算:

1.2.8 数据处理 应用SAS软件和Excel软件进行数据分析。显著性检验为邓肯检验，显著水平设置为α=0.05。所有实验数据取3次平行结果的平均值。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的选择

经酶活力测定，碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶酶活力分别为12.5万 U/g、8.5万U/g、2.2万 U/g。根据1.2.2方法加入各酶反应，酶解产物的氮收率、水解度和平均肽链长度结果见表2和表3。

表2 酶对氮收率、水解度和平均肽链长度的影响Table 2 Effect of enzyme on the nitrogen yield，degree of hydrolysis and average length of peptide chain

由表2和表3可知，酶的种类对酶解产物的氮收率、水解度和平均肽链长度都有极显著的影响。由表2可知，风味蛋白酶酶解产物的水解度明显高于碱性蛋白酶和胰蛋白酶，平均肽链长度小于其它两种酶。这是因为风味蛋白酶兼有内切和外切双重作用，专一性较弱，能广泛水解多个作用位点［16］，因此，水解液中游离氨基酸和小肽的比例较高，水解度高。而碱性蛋白酶是一种内切酶［17］，作用位点有Ala-、Leu-、Val-、Phe-、Trp-等，专一性高于风味蛋白酶，因此其酶解产物的水解度低于风味蛋白酶，平均肽链长度大于风味蛋白酶;胰蛋白酶也是一种内切酶［18］，优先水解 Lys-、Arg-和 His-的羧基侧的肽链，因此其酶解产物的水解度低于碱性蛋白酶。

为了得到较长的平均肽链长度的水解产物，同时要求氮收率较高，选取碱性蛋白酶。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

2.2 酶解工艺条件的优化

正交实验结果见表4，方差分析见表5。

由表4和表5可知，料液比对平均肽链长度呈显著影响，余下各因素对酶解液的氮收率、水解度及平均肽链长度均有极显著的影响。影响氮收率的各因素的主次顺序为A＞D＞C＞B，即温度＞料液比＞pH＞加酶量，最优组合为A3B3C2D2;影响水解度的顺序为A＞C＞B＞D，即温度＞pH＞加酶量＞料液比，最优组合为A2B1C2D1;影响平均肽链长度的顺序为C＞A＞B＞D，即pH＞温度＞加酶量＞料液比，最优组合为A2B3C2D1。随着加酶量的增加，成本会显著增大，料液比为1∶2时氮收率显著较低，因此，综合考虑氮收率、水解度、平均肽链长度，使酶解液具有较高的氮收率和水解度，同时保持适当的肽链长度，使其主要成分为短肽，因而选择最优组合为A2B1C2D2，即白鲢鱼糜与水质量比以1∶4混合匀浆后，调节起始pH7.5，用2000U/g碱性蛋白酶于55℃水解3h。

表4 正交实验结果Table 4 Results of the orthogonal experiment

表5 正交实验方差分析(F/α)Table 5 Analysis of variance on orthogonal experiment(F/α)

2.3 验证实验

为考察优选工艺的稳定性和实验结果的精确性，将最优化的处理组合进行两次重复性实验。结果表明，在最优组合A2B1C2D2工艺条件下，酶解液的氮收率、水解度和平均肽链长度均较高，其平均肽链长度为3.87，水解度为24.12%，氮收率为91.85%。

3 结论

碱性蛋白酶酶解鲢肉可以获得较高的氮收率、水解度和平均肽链长度，是最合适的酶。其最佳酶解条件为温度55℃、酶浓度2000U/g、pH7.5、料液比1∶4。酶解3h时，鲢鱼酶酶解液的平均肽链长度为3.87，水解度为24.12%，氮收率为91.85%。

［1］戴新明，熊善柏.湖北省淡水鱼加工与综合利用［J］.渔业现代化，2004，2:42-43.

［2］贾敬德.21世纪我国淡水渔业展望［J］.淡水渔业，2000，30(1):3-6.

［3］Liaset B，Lied E，Espe M，et al.Enzymatic hydrolysis of byproducts from the fish-filleting industry:chemical characterization and nutritional evaluation［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80(5):581-589.

［4］李越希，黄培堂.多肽在生物医药和诊断试剂中的应用［J］.中华生化药物体志，2001，22(4):208-210.

［5］朱碧英，毛秀珍.鲢鱼蛋白酶解肽分子组成及其降血脂作用的初步研究［J］.营养学报，2005，27(5):422-424.

［6］Klompong V，Benjakul S，Kantachote D，et al.Comparative study on antioxidative activity of yellow stripe trevally protein hydrolysate produced from Alcalase and Flavourzyme［J］.International Journal of Food Science and Technology，2008，43(6):1019-1026.

［7］黄艳春，熊善柏，赵思明，等.鲢肉酶解工艺及其产物对大鼠ACE抑制活性的研究［J］.食品科学，2006，27(1):203-206.

［8］Margaret M M，Hans M，Richard J F.Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of when protein［J］.International Dairy，1997，7(5):299-303.

［9］李雪，尤娟，罗永康.草鱼肉蛋白酶解物功能特性及质量控制的研究［J］.食品工业科技，2011，32(2):81-84.

［10］Ramon P A，Miguel A M M，Juan C R S.Functional properties of fish protein hydrolysates from Pacific whiting(Merluccius products)muscle produced by a commercial protease Ramón Pacheco-Aguilar［J］.Food Chemistry，2008，109(4):782-789.

［11］唐传核，彭志英.功能性食品基料蛋白质及多肽开发现状［J］.粮食与油脂，2001(1):39-41.

［12］陈胜军，曾名勇.水鱼加工利用的研究进展［J］.中国水产，2002(5):70-71.

［13］孔保华，耿欣，刁新平.鲢鱼肉的营养及理化特性的研究［J］.渔业现代化，2002(4):33-35.

［14］武贤壮.鳞鱼肉蛋白的酶解及产物特性研究［D］.武汉:华中农业大学，2009.

［15］李艳丽，许尧兴，许少春.饲用中性蛋白酶酶活测定的影响因子的研究［J］.中国饲料，2006(19):37-40.

［16］Suthasince N，Sittiwat L，Manop S，et al.Optimization of enzymatic hydrolysis of fish soluble concentrate by commercial proteases［J］.Journal of Food Engineering，2005，70(4):571-578.

［17］Seronei C C，Zhang W，Shi Y.Multivariate strategy in screening of enzymes to be used for whey protein hydrolysis in an enzymatic membrane reactor［J］.International Dairy Journal，2007，17(4):393-402.

［18］易明花，徐尔尼，汪金萍，等.大豆蛋白水解酶及产物测定方法研究进展［J］.大豆科学，2007，26(5):766-770.