庄文婷，朱路平，向 诚，何 静，李 鹏，2，李宝才*

1昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明650500;2澳门大学中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室，澳门000856

活性筛选在天然产物活性成分的研究中被广泛运用，通过活性筛选的方法可以快速获得具有生物活性的先导化合物，所以选择一个可靠性强、操作简单、也能适应大规模筛选的模型尤为重要［1］。目前，被广泛运用于活性筛选的多为各种体外药理模型，相较于体外药理模型，体内药理模型更能模拟体内生理环境，具有更高的可靠性。CAM在研究血管新生方面是一个被公认的可靠性高，操作简单的体内模型［2］。病理性的血管新生会引发风湿性关节炎、糖尿病性失明、系统性红斑狼疮等疾病，其与癌症的发生也有着密切的联系，抑制血管新生剂近年来被视为肿瘤治疗的新途径［3］，因此，寻找具有血管新生抑制作用的活性成分迅速成为药物研究的一大热点。二萜类化合物在云南鼠尾草和丹参中广泛存在，其中，丹参酮ⅡA、隐丹参酮为其特征性成分［4］，并已经报道具有抑制血管新生活性，所以快速有效的分离得到这类成分对于研究开发二萜类抑制血管新生剂有重要的意义。笔者采用CAM活性追踪的分离方法对云南鼠尾草和丹参进行分离，相对快速的获得较大量的丹参酮ⅡA、隐丹参酮，同时首次发现丹参酮Ⅰ、丹参内酯、柳杉醇具有抑制血管新生活性。

1 仪器与材料

1．1 仪器

V-400(瑞士 Brucker)和 DRX-500(英国牛津DRX)超导核磁共振仪;VG AUTO Spec-3000(英国Micromass)和APIQstar Plusar(美国应用生物系统公司)质谱仪;Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent);注射器(1 mL)、砂轮、止血钳、镊子、载玻片、移液枪、透明胶、恒温培养箱、超洁净工作台、数码照相机等。

1．2 材料

Sephadex LH-20(20～100 μm，Pharmacia Fine Chemical Co．，Ltd．)，MCI gel CHP20P(75 ～ 150 μm，Mitsubishi Chemical Co．，Ltd．)，Rp-18(40 ～ 50 μm，Merk Co．，Ltd．)，柱层析硅胶(200 ～300 目)及薄层层析硅胶(GF254)均为青岛海洋化工厂产品;显色剂:5%硫酸-乙醇溶液;柱层析溶剂均为工业级重蒸溶剂、新洁尔灭消毒液、75%乙醇消毒液、生理盐水、地塞米松注射液(购自云南白药)、PBS缓冲液、甲醇(AR)、丙酮(AR)、种蛋(昆明云岭广大种禽饲料有限公司)。

正品丹参(Salvia miltiorrhizaBunge)购自云南福林堂中药房，产自河北;云南鼠尾草药材于2010年8月采自云南省丽江市，由云南省中医中药研究院郭世民研究员鉴定为唇形科植物云南鼠尾草(Salvia yunnanensisC．H．W right)。样本现存于昆明理工大学生命科学与技术学院天然产物制药实验室。

2 活性部位的筛选

2．1 极性段的划分

干燥云南鼠尾草(6 kg)全草，粉碎过60目筛，用100%丙酮(每次20 L)室温下超声提取三次，每次2 h，提取液减压浓缩得粗浸膏200 g。所得浸膏经硅胶柱色谱石油醚-乙酸乙酯梯度(1∶0、9∶1、3∶1、1∶1、3∶7)洗脱，TLC 检测合并得 5 个部分，Fr．1(50 g)、Fr．2(32 g)、Fr．3(14 g)、Fr．4(26 g)、Fr．5(60 g)。

干燥正品丹参(2 kg)，粉碎过60目筛，用100%丙酮(每次20 L)室温下超声提取三次，每次2 h，提取液减压浓缩得粗浸膏78 g。同上述方法将所得粗浸膏进行极性段划分，得到5个部分，分别为:Fr．1'(16 g)、Fr．2'(10 g)、Fr．3'(8 g)、Fr．4'(15 g)、Fr．5'(20 g)。

2．2 极性段的活性筛选

采用鸡胚尿囊膜模型(CAM)对各极性段进行活性筛选，实验设置空白组和阳性对照药组(地塞米松)，以及 Fr．1、Fr．2、Fr．3、Fr．4、Fr．5(Fr．1'、Fr．2'、Fr．3'、Fr．4'、Fr．5')五个给药组，每组6 只造模成功的鸡胚，将各极性段物质用无水乙醇配制成400 μg/mL的溶液待用。购买的活鸡胚在孵育箱中以37°C、CO25%、湿度适宜的条件孵育7 d后，在气室端开窗(1×1 cm)，用直径为6 mm的无菌滤纸片作为给药载体，给药组在滤纸片上加入20μL配制好的溶液，在超净台中将无水乙醇挥干，放置于尿囊膜上，每只鸡胚加入20μL生理盐水便于给药片与尿囊膜贴合，空白组在滤纸片上加20μL无水乙醇，在超净台中将无水乙醇挥干，放置于尿囊膜上，每只鸡胚加入20μL生理盐水便于给药片与尿囊膜贴合，用无菌透明胶带封窗后放入孵育箱中继续孵育48 h后，滴入固定液(甲醇-丙酮1∶1)将尿囊膜上的血管做固定处理，然后取下尿囊膜组织，数码相机微距拍照，图片用IPP图像处理软件对血管面积进行计算［5］。结果见图 1 A(云南鼠尾草)、B(丹参)，从图中可以看出云南鼠尾草中 Fr．2、Fr．3、Fr．4 有较好的活性;丹参中Fr．2'和Fr．4'有较好的活性。

图1 云南鼠尾草(A)及丹参(B)各极性段CAM血管生长面积点数Fig.1 The vascular area dots of CAM with different fractions from S．yunnanensis(A)and S．miltiorrhiza(B)．

3 活性极性段的分离

3．1 云南鼠尾草活性极性段分离

从 CAM 活性筛选结果中选定 Fr．2、Fr．3、Fr．4三个极性段进行进一步的分离。Fr．2(32 g)的分离:经硅胶柱层析，石油醚-氯仿(50∶50 ～0∶100)梯度洗脱，TLC检测合并相同组分，所得Fr．1(1)反复上硅胶柱得化合物1(240 mg)，Fr．1(2)反复上硅胶柱得到化合物2(46 mg)，化合物3(33 mg)。Fr．3(14 g)的分离:以石油醚-乙酸乙酯(15∶1、9∶1、7∶1、5∶1、2∶1)梯度洗脱，洗脱样品馏分分瓶收集，常温析出结晶，吸出母液，以少量石油醚洗涤结晶得到红色块状结晶，得到化合物4(13 g)，其他组分经硅胶柱色谱及Sephadex LH 20凝胶纯化得到化合物5(10 mg)。Fr．4(26 g)的分离:经硅胶柱层析，氯仿-乙酸乙酯-甲醇(90∶10∶10 ～50∶50∶10)三项系统梯度洗脱，TLC检测合并相同组分，所得组分反复上硅胶柱，利用HPLC半制备液相制备得到化合物6(18 mg)，Fr．4(2)反复上 Sephadex LH 20凝胶柱得到化合物7(7 mg)，Fr．4(3)反复上硅胶柱，所得溶液放置析出白色块状晶体，石油醚反复洗涤得到化合物8(15 mg)。

3．2 丹参活性极性段分离

从 CAM 活性筛选结果中选定 Fr．2'、Fr．4'两个极性段极性分离，Fr．2'(10 g)的分离:以石油醚-乙酸乙酯(15∶1、9∶1、7∶1、5∶1、2∶1)梯度洗脱，洗脱样品馏分分瓶收集，常温析出结晶，反复洗涤得到化合物1'(160 mg)，母液利用TLC检测合并为三个部分，第一部分经过反复硅胶柱层析纯化得到化合物2'(20 mg)。Fr．4'(15 g)的分离:经 MCI柱层析MeOH-H2O(50%、70%、80%、90%)梯度洗脱，50%MeOH-H2O洗脱部分反复硅胶柱色谱得化合物3'(10 mg)，70%MeOH-H2O洗脱部分反复硅胶柱色谱和Sephadex LH-20纯化得化合物4'(16 mg)、化合物5'(50 mg)。

通过TLC及HPLC检测分析发现，云南鼠尾草中分离得到的化合物1、3、6、7分别与丹参中分离得到的化合物 1'、2'、3'、4'的Rf值和保留时间相同，因此将这8个化合物合并标记为化合物1、3、6、7。

4 结构鉴定

化合物1 红色粉末，ESI-MSm/z:295［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:1.82(2H，m，H-1)，1.67(2H，m，H-2)，3.19(2H，m，H-3)，7.60(1H，d，J=6.4 Hz，H-6)，7.56(1H，d，J=6.4 Hz，H-7)，7.25(1H，s，H-16)，2.24(3H，s，Me-17)，1.26(6H，s，Me-18，Me-19);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:29.9(C-1)，19.4(C-2)，37.7(C-3)，34.9(C-4)，150.4(C-5)，133.6(C-6)，120.5(C-7)，127.7(C-8)，126.0(C-9)，144.5(C-10)，183.3(C-11)，174.9(C-12)，121.4(C-13)，161.9(C-14)，120.5(C-15)，142.0(C-16)，9.2(C-17)，33.1(C-18，C-19)。以上波谱数据与文献［7］报道基本一致，故鉴定化合物1为丹参酮ⅡA。

化合物2 无色针状结晶，EI-MSm/z:264(［M］+，100)，263(33)，208(25)，184(24)，165(20);1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:8.34(1H，d，J=8.2，H-1)，7.39(1H，dd，J=8.2，8.2，H-2)，7.35(1H，d，J=8.2，H-3)，7.75(1H，d，J=8.8，H-6)，7.69(1H，d，J=8.8，H-7)，7.35(1H，s，H-16)，2.34(3H，s，Me-17)，2.63(3H，s，Me-18);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:120.3(C-1)，126.5(C-2)，127.9(C-3)，135.5(C-4)，124.5(C-5)，120.7(C-6)，116.6(C-7)，109.2(C-8)，108.0(C-9)，132.9(C-10)，157.9(C-11)，159.0(C-13)，149.0(C-14)，141.0(C-15)，120.3(C-16)，8.4(C-17)，19.5(C-18)。以上波谱数据与文献［7］报道基本一致，故鉴定化合物2为丹参内酯。

化合物3 紫红色粉末，ESI-MSm/z:277［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:9.24(1H，d，J=8.8 Hz，H-1)，7.53(1H，dd，J=8.8 Hz，H-2)，7.29(1H，d，J=8.8 Hz，H-3)，8.28(1H，d，J=8.8 Hz，H-6)，7.79(1H，d，J=8.8 Hz，H-7)，7.30(1H，s，H-16)，2.30(3H，s，Me-17)，2.70(3H，s，Me-18);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:124.9(C-1)，130.7(C-2)，128.6(C-3)，134.9(C-4)，133.7(C-5)，133.0(C-6)，119.0(C-7)，129.5(C-8)，123.0(C-9)，133.0(C-10)，183.6(C-11)，176.1(C-12)，122.0(C-13)，161.2(C-14)，120.8(C-15)，142.3(C-16)，8.5(C-17)，20.0(C-18)。以上波谱数据与文献［7］报道基本一致，故鉴定化合物3为丹参酮Ⅰ。

化合物4 红色粉末，ESI-MSm/z297［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:3.18(2H，m，H-1)，1.73(2H，m，H-2)，1.62(2H，m，H-3)，7.61(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，7.46(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，3.54(1H，m，H-15)，4.86(1H，t，J=9.2 Hz，H-16a)，4.32(1H，dd，J=6.0，9.2 Hz，H-16b)，1.18(3H，s，Me-17)，1.30(3H，s，Me-18)，1.33(3H，s，Me-19);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:29.7(C-1)，19.3(C-2)，37.9(C-3)，34.8(C-4)，152.4(C-5)，132.8(C-6)，122.5(C-7)，128.5(C-8)，126.9(C-9)，143.7(C-10)，184.5(C-11)，175.7(C-12)，118.4(C-13)，170.8(C-14)，34.5(C-15)，81.4(C-16)，18.8(C-17)，31.9(C-18)，31.8(C-19)。以上波谱数据与文献［6］报道基本一致，故鉴定化合物4为隐丹参酮。

化合物 5 白色固体，1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:0.75，0.83，0.85，0.88，0.89，0.93，0.98，1.12(each 3H，Me-23，24，25，26，27，28，29 and 30)，3.20(1H，m，H-3)，5.15(1H，m，H-12);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:38.7(C-1)，27.0(C-2)，79.0(C-3)，38.97(C-4)，55.1(C-5)，18.5(C-6)，32.7(C-7)，39.7(C-8)，47.8(C-9)，37.3(C-10)，23.4(C-11)，121.7(C-12)，145.0(C-13)，41.7(C-14)，28.3(C-15)，26.2(C-16)，32.5(C-17)，47.5(C-18)，46.8(C-19)，31.1(C-20)，34.8(C-21)，37.2(C-22)，28.1(C-23)，15.7(C-24)，15.5(C-25)，16.9(C-26)，26.5(C-27)，27.7(C-28)，33.2(C-29)，23.6(C-30)。以上波谱数据与文献［7］报道基本一致，故鉴定化合物 5为 β-Amyrin。

化合物6 红色粉末，ESI-MSm/z:279［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:9.28(1H，d，J=8.8 Hz，H-1)，7.57(1H，t，J=8.8 Hz，H-2)，7.40(1H，d，J=8.8 Hz，H-3)，8.28(1H，d，J=8.8 Hz，H-6)，7.75(1H，d，J=8.8 Hz，H-7)，3.63(1H，m，H-15)，4.96(1H，t，J=9.6 Hz，H-16α)，4.44(1H，dd，J=6.4，9.6 Hz，H-16β)，1.39(3H，d，J=7.0 Hz，Me-17)，2.70(3H，s，Me-18);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:124.9(C-1)，130.4(C-2)，128.8(C-3)，134.9(C-4)，134.7(C-5)，131.9(C-6)，120.2(C-7)，128.1(C-8)，125.9(C-9)，132.0(C-10)，184.2(C-11)，175.6(C-12)，118.3(C-13)，170.6(C-14)，34.6(C-15)，81.6(C-16)，18.8(C-17)，19.8(C-18)。以上波谱数据与文献［8］报道基本一致，故鉴定化合物6为二氢丹参酮Ⅰ。

化合物7 白色颗粒状晶体，ESI-MS:m/z 301［M+H］+，323 ［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:0.86(3H，s，Me-18)，0.92(3H，s，Me-19)，1.12(3H，s，Me-20)，1.13(6H，d，J=6.4 Hz，Me-16，Me-17)，1.18 ～ 2.48(6H，m，H-1，H-2，H-3)，1.71(1H，m，H-5)，2.48(2H，m，H-6)，3.13(1H，sept，J=6.4 Hz，H-15)，6.78(1H，s，H-11)，7.64(1H，s，H-14)，10.27(1H，s，OH-12);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:37.5(C-1)，18.5(C-2)，40.9(C-3)，32.9(C-4)，49.1(C-5)，35.6(C-6)，196.6(C-7)，122.6(C-8)，155.9(C-9)，39.1(C-10)，109.4(C-11)，160.2(C-12)，132.6(C-13)，125.1(C-14)，26.1(C-15)，22.3(C-16)，22.4(C-17)，32.3(C-18)，21.2(q，C-19)，23.1(C-20)。以上波谱数据与文献［9］报道基本一致，故鉴定化合物7为柳杉醇。

化合物 8 白色固体，1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:0.85，0.97，0.98，0.99，1.04，1.07(each 3H，s Me-23，24，25，26，27，29，30)，3.47(1H，dd，J=5.95，4.0，H-3)，5.35(1H，t，J=3.5，H-12);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:39.7(C-1)，37.9(C-2)，78.7(C-3)，39.5(C-4)，55.7(d，C-5)，19.0(C-6)，31.6(C-7)，39.5(C-8)，49.4(C-9)，39.8(C-10)，23.7(C-11)，126.0(C-12)，139.7(C-13)，40.5(C-14)，28.7(C-15)，25.5(C-16)，48.5(C-17)，53.9(C-18)，39.5(C-19)，39.8(C-20)，31.8(C-21)，37.6(C-22)，28.9(C-23)，24.5(C-24)，15.7(C-25)，17.1(C-26)，23.3(C-27)，179.9(C-28)，16.6(C-29)，21.5(C-30);以上波谱数据与文献［10］报道基本一致，故鉴定化合物8为urosolic acid。

化合物5' 黄色粉末;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:5.47(1H，d，J=10.2，H-2)，3.20(1H，m，H-3α)，2.69(1H，m，H-3β)，5.95(2H，brs，H-6，H-8)，7.38(2H，d，J=8.8，H-2'，H-6')，6.69(2H，d，J=8.8，H-3'，H-5');13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:79.6(C-2)，43.6(C-3)，197.4(C-4)，165.5(C-5)，96.6(C-6)，167.4(C-7)，95.5(C-8)，164.3(C-9)，103.3(C-10)，130.7(C-1')，129.0(C-2'and 6'0，116.4(C-3'，C-5')，158.9(C-4')。以上波谱数据与文献［7］报道基本一致故鉴定化合物 5'为 5，7，4'-Trihydroxy flavanone。

5 化合物活性筛选

从云南鼠尾草和丹参中分离得到的9个化合物，采用CAM模型对其进行抑制血管新生活性的筛选，实验设置空白组和阳性对照药组(地塞米松组)，以及化合物 1、2、3、4、5、6、7、8、5'9 个给药组，每组6只鸡胚，将各化合物用无水乙醇配制成0.08 nmol/L的溶液待用。其余步骤与2.2所述方法相同。实验结果如表1，图2、3所示，实验结果显示:化合物1、2、3、4、7有较好的抑制血管新生活性。

6 数据处理

CAM血管面积计数通过IPP软件计算得到，根据血管颜色与尿囊膜组织颜色的区别，利用IPP软件滤镜处理技术，增强颜色对比，通过采集图像上的不同色彩点数来计算得到血管面积;得到的血管面积数据用SPSS数据处理软件处理，得到T检验数据。

表1 各化合物对血管生长的抑制作用(n=6±s)Table 1 Inhibition of vascular growth on CAM by the isolated compounds(n=6±s)

表1 各化合物对血管生长的抑制作用(n=6±s)Table 1 Inhibition of vascular growth on CAM by the isolated compounds(n=6±s)

注:与空白对照组比较，*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05;＊＊ P ＜ 0.01;＊＊＊ P ＜0.001.

组别Group浓度Concentration(nmol/L)血管面积数Vascular area date(dots)抑制率Inhibition ratio(%)69.6化合物2 Compound 2 0.8 257±95＊＊ 25.1化合物3 Compound 3 0.8 189±44＊＊ 44.9化合物4 Compound 4 0.8 107±46＊＊＊ 68.8化合物5 Compound 5 0.8 421±87 -22.7化合物6 Compound 6 0.8 423±70 -23.3化合物7 Compound 7 0.8 110±61＊＊＊ 67.9化合物8 Compound 8 0.8 373±86 -0.1化合物5'Compound 5' 0.8 400±100 -16.7地塞米松 Dexamethasone 92±20＊＊＊ 73.1生理盐水化合物1 Compound 1 0.8 104±50＊＊＊Normal saline 343±72

7 讨论

目前，基于活性追踪为指导的化合物分离方法大都选用细胞株、菌种以及各种色谱设备作为筛选模型，由于与体内环境相差较大，常导致体内重现性较差的问题出现。寻找到合适的体内的模型可以优化活性筛选的方法，达到快速有效的筛选目的。鸡胚尿囊膜模型(CAM)是目前被公认的可靠性高，操作简单，成本低廉的抑制血管新生的体内药理模型，相较于目前较为成熟的人脐静脉内皮细胞的血管新生体外药理模型，其在成本和操作性上都有明显优势，研究过程中运用CAM首先明确活性部位，有效加快了活性化合物的分离速度，显著提高了分离的目的性和可靠性。通过进一步的活性追踪和化学分离鉴定，成功获得一定量的丹参酮ⅡA、隐丹参酮，并且首次证实了丹参酮Ⅰ、丹参内酯、柳杉醇具有抑制血管新生的活性。为今后研究中快速获得二萜类抑制血管新生活性的化合物提供了一条新的有效的途径，同时，这种快速分离的方法也为研究具有促进血管新生等生物活性的天然产物活性成分的分离提供一种新的分离模式。

此外，在本研究中发现，具有活性的化合物均为松香烷型二萜类物质，其中，在CAM中显示出较好抑制血管新生活性的丹参酮ⅡA、隐丹参酮，在结构方面有明显的共同点，在A环4位上均有两个甲基取代，都有醌类结构，13，14位均接有含氧呋喃环，这些结构特征有助于在今后的研究中从结构方面研究此类物质对血管新生的影响;但是，在分离过程中得到的二氢丹参酮Ⅰ也是一种松香烷型二萜物质，但其在CAM模型上并未表现出抑制血管新生的活性，因此，对于松香烷型二萜类物质与血管新生的影响还需要做进一步的构效关系研究。

致谢:化合物波谱数据由中国科学院昆明植物研究所分析测试中心测定。

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