王雪梅，薄 磊，祁 晶，余占海，马兴铭

1兰州大学口腔医学院;2兰州大学基础医学院，兰州730000

复发性阿弗他溃疡(recurrent aphthous ulcer，RAU)也称复发性口腔溃疡，是口腔黏膜常见的溃疡类疾病，主要发生于口腔内前庭、唇颊粘膜、软腭、舌腹等非角化部位，以女性多发，在世界范围内患病率高达 25%［1，2］，该病病因复杂，发病机理尚不清楚，近年来有学者认为免疫功能失调是RAU最重要的发病机制，增强机体免疫力，能够减少溃疡发作的频率，缩短病程［3］。黄芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)作为中药黄芪中重要的天然有效活性成分，具有抗应激、抗氧化、增强免疫功能等的免疫调节效应［4］。因此，本实验通过建立SD大鼠RAU动物模型，观察黄芪多糖对实验性RAU的伤口愈合及淋巴细胞亚群的影响，为黄芪多糖在口腔溃疡治疗中的应用提供实验研究依据。

1 材料与方法

1．1 RAU模型建立与分组

完全弗氏佐剂(美国Sigma公司);黄芪多糖(杨凌东科麦迪森制药有限公司);抗CD4+-FITC、抗 CD8+-FITC(Multi Sciences Biotech Co，Ltd)。SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体重约200～250 g，购于甘肃省中医学院实验动物中心(合格证:医动字第14-005号)。

将大鼠分实验组(32只，雌雄各半)和正常对照组(8只)。正常对照组不给予任何处理，实验组用免疫学方法建立RAU模型［5］:制备含完全弗氏佐剂的大鼠口腔黏膜组织抗原乳化液(放置后不分层)。实验组大鼠脊柱两侧各选一点皮内注射黏膜组织抗原乳化液0．1 mL，每周1次，共注射4周。观察大鼠口腔黏膜出现典型溃疡病损时，即证实成功RAU动物模型。实验组大鼠随机分为黄芪多糖高、中、低剂量治疗组及模型对照组，每组8只。

1．2 治疗

黄芪多糖高(300 mg/kg)、中(200 mg/kg)、低(100 mg/kg)剂量治疗组大鼠分别给予0．5 mL药物溶液灌胃，模型对照组及正常对照组以等量生理盐水灌胃，每天1次，连续灌胃治疗20 d。

1．3 测量溃疡面直径及溃疡组织病理学检查

观察药物治疗前、治疗20d后各组大鼠的口腔溃疡面的直径，记录口腔溃疡愈合的大鼠只数并计算愈合率，愈合标准［6］:溃疡直径＜1 mm为愈合，溃疡直径≥1 mm为未愈合。同时取正常大鼠口腔粘膜组织、造模成功后口腔溃疡粘膜组织及治疗后愈合大鼠口腔溃疡黏膜组织，HE染色观察溃疡组织的病理学变化。

1．4 外周血T淋巴细胞亚群的测定

治疗20 d后，乙醚麻醉大鼠，自眶静脉取血，淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，并PBS洗涤并调成细胞悬液，按照试剂盒说明分别加标记的抗CD4+、CD8+单克隆抗体，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)检测CD4+T细胞和CD8+T细胞百分率。

1．5 血浆EGF含量的检测

将血液标本用抗凝剂处理后(抗凝是血浆)，静置30 min，于4℃下2500 rpm冷冻离心15 min，取上层血浆置-20℃贮存，酶联免疫吸附法(ELISA)测定EGF含量，操作按说明书进行。

1．6 统计学分析

所有实验数据用SPSS16．0统计软件统计分析，结果用均数±标准差±s)表示。

2 结果

2．1 溃疡面直径及溃疡组织病理学改变

大鼠在黏膜组织抗原注射后第3周，口腔黏膜局部充血、红肿，至第4周出现溃疡，并逐渐增大，多位于颊粘膜及牙龈部，直径1．5～2．5 mm，边缘整齐，表面有灰黄色假膜覆盖。药物治疗20d后，与模型对照组相比(溃疡直径2．0 ±0．50 mm，愈合率为12．5%)，黄芪多糖药物促进溃疡面愈合，使溃疡面积减小(黄芪多糖低剂量组溃疡直径1．0±0.23 mm)，使大鼠口腔溃疡愈合只数增加，黄芪多糖中(溃疡直径0．50 ± 0．37 mm)、高剂量组(溃疡直径0．0 ±0．00 mm)的愈合率均为100%(表1)。口腔黏膜溃疡组织的病理学观察可见:模型对照组大鼠黏膜上皮溶解、破溃形成溃疡，表面有纤维素性渗出物覆盖，固有层内毛细血管扩张充血，血管周围有大量淋巴细胞等炎性细胞浸润(图1B)。黄芪多糖低剂量组未完全愈合大鼠黏膜组织显示上述病理表现缓解，上皮完整性基本恢复，淋巴细胞浸润及渗出物明显减少(图1C)。

图1 黄芪多糖治疗后大鼠的口腔黏膜溃疡病理学变化Fig.1 Pathological changes of rat oralmucosa after APS treatment

2．2 外周血T淋巴细胞亚群的变化

连续灌胃20 d后，各组大鼠外周血CD4+T细胞数、CD8+T细胞数的变化见表1。与正常对照组比，模型对照组大鼠外周血中CD4+T细胞数减少、CD8+T细胞数升高，CD4+/CD8+比值下降，有显著性差异(P＜0．05);与模型对照组比，黄芪多糖药物治疗组的大鼠外周血中CD4+T细胞数升高、CD8+T细胞数降低，CD4+/CD8+比值明显回升，有统计学差异(P＜0．05)，且随着黄芪多糖剂量的增加，其数值越接近正常对照组。

2．3 血浆EGF的水平

从统计结果看，SD大鼠造模前实验组血浆EGF含量为286．40 ±5．36，造模后血浆 EGF含量为259．4 ± 6．24(P＜ 0．05)，造模前后差异有统计学意义，见表2。造模后EGF含量的变化:第1周两组血浆EGF无明显变化，第4周实验组血浆EGF含量出现明显下降。黄芪多糖灌胃治疗后血浆EGF含 量上升，尤其以中、高剂量组表现明显。

表1 黄芪多糖治疗后大鼠口腔溃疡面直径、愈合率及外周血T细胞亚群的变化Table 1 Diameters of oral ulcers，the healing rates and peripheral blood T cell subsets of rats after APS treatment

表2 SD大鼠造模前后血浆EGF及黄芪多糖治疗后EGF含量比较(ng/L)Table 2 Plasma EGF levels in the SD ratmodel and EGF levels in the treatment of Astragalus polysaccharide(ng/L)

3 讨论

复发性阿弗他溃疡是一类常见的口腔黏膜炎性疾病，本病病因复杂，局部创伤、精神压力、食物过敏、维生素及微量元素缺乏及遗传倾向、免疫失调等系统性因素在某些患者的发病过程中具有一定作用［7］。

表皮生长因子(EGF)除可以影响与组织修复有关的细胞，如表皮细胞、成纤维细胞以及内皮细胞等的细胞周期转换以加速细胞的分裂、增殖外，还可以促进组织修复细胞内DNA、RNA及蛋白质合成，这些均是 EGF参与组织修复的生物学基础［8］。孙鹏［9］认为发生口腔溃疡时各种来源的EGF均减少，使口腔黏膜细胞再生能力受抑，最终导致黏膜溃疡形成。EGF可刺激口腔黏膜的生长和分化，尤其与基底细胞增殖的关系更为密切［10］。研究表明EGF浓度改变与口腔黏膜耐受创伤和创伤后愈合能力的强弱有密切关系［11］。EGF在正常口腔黏膜中的表达主要分布在基底细胞层，本研究发现在正常口腔粘膜的基底细胞层细胞排列整齐，正常口腔黏膜的基底细胞和棘细胞可以产生EGF，并以自分泌和旁分泌的方式作用于上皮细胞，维持口腔黏膜上皮细胞的分化和增殖。而发生口腔溃疡时基底细胞层结构紊乱，EGF的自分泌和旁分泌受到抑制，EGF值明显降低(P＜0．05)使口腔粘膜细胞再生增殖能力受到抑制，从而发生溃疡。而在以黄芪多糖灌胃治疗后，基底细胞层细胞排列又变得有序整齐，EGF值明显升高，口腔粘膜上皮分泌EGF的功能恢复，溃疡逐渐愈合。

上世纪60年代末，Lehner等首次提出细胞介导的免疫反应在复发性阿弗他溃疡的发生发展过程中具有重要作用，这一观点也被越来越多的学者所证实［12］。在正常情况下，CD4+T细胞和CD8+T细胞之间相互平衡，维持着正常的细胞免疫功能，而平衡被打破时，造成机体免疫功能的下降及紊乱，诱发非正常自身免疫反应，在口腔中表现为口腔黏膜上皮的溶解、破坏和组织坏死［9］，CD4+T细胞、CD8+T细胞亚群的比例会随溃疡的发生、发展、愈合而不断变化［13］。本文的研究结果与 S．Sistig 等［14］的研究不同，但与程茜［5］等人的研究报道一致，S．Sistig等［14］采用流式细胞仪对RAU患者和正常人的外周血T细胞亚群进行检测，发现RAU患者外周血T细胞亚群中CD4+T细胞比例明显低于正常人群，而CD8+的T细胞比例正常。本实验利用免疫方法建立阿弗他溃疡动物模型，通过大鼠外周血T细胞亚群的测定发现:与正常对照组相比，RAU大鼠血液中CD4+T细胞数量下降、CD8+T细胞数量升高，CD4+/CD8+比值下降，差异具有统计学意义。表明细胞免疫功能紊乱是RAU发病过程中的一个重要环节。

黄芪多糖是黄芪的主要天然有效活性成分，具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化及免疫调节等多种药理作用［4］。一方面，黄芪多糖药物促进口腔粘膜上皮基底细胞层EGF的分泌，维持口腔粘膜上皮的再生与增殖，使溃疡面积减小，大鼠黏膜组织的炎症表现有所缓解，淋巴细胞浸润减少，上皮恢复完整性，高、中剂量组的愈合率100%。另一方面，黄芪多糖作为一种免疫调节剂，黄芪多糖能使大鼠淋巴细胞活性明显升高，促进TNF-α、IL-β、IL-2等细胞因子发的分泌及IgA、IgG、IgM抗体的产生，从而发挥抗炎及显著增强免疫作用［15］。本实验用不同剂量APS连续灌胃治疗20 d，APS可明显改善RAU实验性大鼠T细胞亚群的失衡状态，外周血中CD4+T细胞的百分比明显回升，CD8+T细胞数量降低及CD4+/CD8+比值升高，尤其在APS高剂量(300 mg/kg)的治疗组中，CD4+T细胞、CD8+T细胞的百分比与正常对照组接近，提示APS能够对RAU实验性大鼠淋巴细胞亚群的失衡起调节作用，且显示出剂量依赖性关系。因此，黄芪多糖具有明显地促进口腔溃疡愈合的作用，改善RAU实验性大鼠T细胞亚群的失衡状态，可作为一种潜在的用于治疗和预防RAU的发生的中药，但其调节RAU实验性大鼠淋巴细胞亚群的机制仍需进一步研究。

1 Splieth CH，Sumnig W，Bessel F，et al．Prevalence of oral mucosal lesions in a representative population．Quintessence Int(Berlin，Germany)，2007，38:23-29．

2 Rima AS．Prevalence of recurrent aphthous ulceration in Jordanian dental patients．BMCOral Health，2009，9:31．

3 Sun LF(孙黎飞)，Liu HJ(刘海军)，Yu GY(于光远)，et al．Cellular immune function of patients with recurrent oral ulcers．Chin J Immunol(中国免疫学杂志)，2001，17:332-333．

4 Dou H(窦辉)，Fu TJ(付铁军)，Zhang F(张帆)，et al．The chemical composition of Astragalus polysaccharide injection．Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2002，6:14-17．

5 Cheng X(程茜)，Liu JG(刘建国)，Guo YS(郭玉书)，et al．Establishing recurrent aphthous ulcer(ROU)models of rat．JClin Stomatol(临床口腔医学杂志)，2008，24:563-565．

6 Yang AP(杨安平)，Zhang XL(张晓林)，Liu AP(刘爱平)，et al．Compound aloe polysaccharide film former research on the role of oral ulcers in rats．JFoshan Univ(Natural Science Edition)(佛山科学技术学院学报:自然科学版)，2007，3:46-48．

7 Rhee SH，Kim YB，Lee ES．Comparison of Behcet's disease and recurrent aphthous ulcer according to characteristics of gastrointestinal symptoms．J Korean Med Sci，2005，20:971-976．

8 Xu J(徐俊)，Wang PH(王鹏华)．Research progress of the epidermal growth factor treatmentof diabetic footulcers．Int J Endocrinol Metabol(国际内分泌代谢杂志)，2007，4:44-46．

9 Sun P(孙鹏)，Fu XB(付小兵)．Lymphocytes，cytokines and recurrent aphthous ulcers．Med JChin PLA(解放军医学杂志)，2004，29:180-181．

10 Fatimah SS，Tan GC，Chua KH，et al．Effects of epidermal growth factor on the proliferation and cell cycle regulation of cultured human amnion epithelial cells．J Biosci Bioeng，2012，114:220-227．

11 Young SK，Dae HL，Kwan CT，et al．Effect of recombinant human epidermal growth factor against cutaneous scar formation in murine full-thickness wound healing．J Korean Med Sci，2010，25:589．

12 Pekiner FN，Aytugar ED，Gulderen Y，et al．Interleukin-2，interleukin-6 and T regulatory cells in peripheral blood of patients with Behcet's disease and recurrent aphthous ulcerations．JOral Pathol Med，2012，41:73-79．

13 Li BQ(李秉琦)．Diseases of the Oral Mucosa(口腔粘膜病学)．Beijing:People’s Health Publishing House，2003．

14 Sistig S，Cekic-Arambasin A，Rabatic S，et al．Natural immunity in recurrent aphthous ulceration．J Oral Pathol Med，2000，30:275-280．

15 Li R，Chen WC，Wang WP，et al．Extraction，characterization of astragalus polysaccharides and its immunemodulating activities in rats with gastric cancer．Carbohydrate Polymers，2009，78:738-742．