武香玉，徐海燕，辛国芹，赵 影，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000）

乳杆菌作为动物肠道的优势菌群之一，其对生物体的益生作用已被许多研究结果证实。而目前对乳杆菌特性的研究多限于乳品、植物等来源的乳杆菌，动物源乳杆菌虽然也被应用，但对其生物特性研究和筛选的报道却不系统和全面。本试验以鸡肠道黏膜为分离源分离乳酸菌并鉴定，并对其生物学特性进行了研究，以期为微生态制剂的开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 分离源

泰安鸡的肠道黏膜。

1.1.2 培养基

乳酸菌发酵培养基：改良的MRS培养基，添加CaCO31%[1]。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的分离筛选

初筛：健康鸡解剖后无菌剪开小肠，无菌棉拭子蘸取小肠黏膜黏液，将棉拭子置于无菌水（带玻璃珠）中震荡，将样品充分打散混匀，取振荡液依次稀释至10-2、10-3、10-4，各稀释度取0.1mL涂平板（MRS），2个重复，于37℃培养箱培养。分离纯化菌株，4℃保藏备用。

复筛测定产酸性能，将分离的菌种以2%接种量接种于改良的MRS培养基中，37℃静置培养，测定发酵液的pH。

1.2.2 菌种的鉴定

生理生化试验、分子鉴定（16S rRNA）[2-4]。PCR扩增引物为 1492r 5'-ggttaccttgttacgactt-3'，27f 5'-agagttgatcctggctcag-3'。菌落PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1 min，72℃延伸2min，25个循环，72℃延伸10 min。PCR产物经salt-free纯化后，测序由博尚生物技术有限公司完成，要求双向测通。将拼接后的序列结果输入www.NCBI.nlm.nih.gov/blast，与Gen-Bank数据库中的序列进行同源性比对。

1.2.3 菌株特性研究

生长曲线的测定：以2%接种量将G-2-1接种于改良的MRS培养基中，37℃静置培养，于0、4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、32 h取样测定pH以及活菌数，以培养时间为横坐标，相应的活菌数与pH为纵坐标，绘制生长曲线，找出最佳培养时间。

耐酸性试验：取发酵22 h的菌液，离心，弃上清，生理盐水洗涤，加入生理盐水5mL，盐酸调节使其pH分别为2.0、3.0、4.0、5.5（对照），再定容至10mL，37℃培养2 h。平板计数，计算存活率（%）。

耐胆盐试验：在MRS培养基中加入猪胆酸盐，使其质量分数分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，不加胆盐的MRS培养基为对照，菌液按1%的接种量接种，37℃培养30min。平板计数，计算存活率（%）。

体外抑菌试验参照徐海燕等方法[5]。

1.3 数据分析

试验结果与Genbank数据库的序列作比对，采用MEGA软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选结果

从5份鸡样品中分出14株在添加CaCO3的MRS平板上能够有透明圈的菌株，各菌株发酵液pH见表1。由表1可以看出，14株菌产酸能力均较好，有13株菌的发酵液pH＜4，其中以G-2-1发酵液pH最低，为3.60。

2.2 菌株鉴定结果

菌株G-2-1生理生化特征分析结果见表2。

表1 G-2-1等菌株发酵液的pH

表2 G-2-1生理生化特性结果

菌株G-2-1的16S rRNA PCR电泳图见图1，条带在1 000～2 000 bp，约为1 500 bp。由测序结果可知，其序列长度为1 437 bp。其具体序列见图2。

图1 G-2-1PCR电泳图

将图2序列输入www.NCBI.nlm.nih.gov/blast，与Genbank数据库的序列作比对，进行同源性分析，得到最相似的物种名，登录号及其相似率，见表3。

图2 菌株G-2-1的序列

表3 G-2-1的16S rRNA同源性比较

根据BLAST比对的结果初步鉴定G-2-1为Lactobacillus salivarius，然后从EMBL等数据库中筛选相关模式菌株的16S rRNA序列，将G-2-1序列与模式菌株序列一起经Clusta X1.83软件进行多序列比对，采用软件MEGA构建系统发育树，见图3。从图3可以看出，G-2-1与AF089108在1个分支，Bootstrap值为99，是可信的。因此将菌株G-2-1鉴定为唾液乳杆菌。

2.3 菌株特性试验研究结果

2.3.1 生长曲线的绘制

生长曲线见图4。由图4可见，G-2-1约在4 h进入对数期，10 h后稳定增长，在20 h活菌数达最高26.5×108cfu·mL-1。G-2-1在进入对数期后pH急剧降低，稳定期时，pH较低，产酸能力较强。

2.3.2 耐酸性试验结果

耐酸性试验结果见表4。

由表4结果可知，在pH＞3时G-2-1生长良好，存活率菌＞100%，酸度对其生长无影响，可能会促进其生长，在pH 2.0时存活率为27.6%。

2.3.3 耐胆盐试验结果

乳酸菌的另一个重要特征是对胆汁的耐受程度，乳酸菌要到达并定植于肠道，必须对胆盐有一定的耐受性，对胆盐的耐受程度决定了其在肠道中的存活能力。耐胆盐试验结果见表5。

图3 菌株G-2-1系统发育树

图4 G-2-1的生长曲线

表4 G-2-1的耐酸性试验结果

表5 G-2-1在不同浓度胆盐中的生长情况

由表5结果可知，在胆盐浓度＞0.2%时严重影响菌株生长，存活率＜5.1%，胆盐浓度0.1%时对其生长基本无影响，存活率达99.2%，G-2-1的耐胆盐能力一般。

2.3.4 体外抑菌试验结果

通过测量抑菌圈直径的大小测量G-2-1对致病菌的体外抑制程度，结果见表6。

表6 G-2-1的抑菌圈直径mm

由表6可以看出，G-2-1对4种致病菌均有抑制作用，尤其是对大肠杆菌，抑制效果较好。这可能是营养竞争、产生H2O2以及细菌素等多方面综合作用的结果。

3 结 论

本试验以鸡肠道黏膜为分离源分离筛选到一株产酸性能良好菌株G-2-1，结合形态观察、生理生化特性分析以及16S rRNA基因序列分析，将此菌株鉴定为唾液乳杆菌。生物学特性试验研究结果表明，G-2-1具有良好的生物学特性，G-2-1在MRS培养基中生长旺盛，20 h时活菌数＞109cfu·mL-1；耐酸效果良好；在胆盐浓度为0.1%时存活率为99.2%；抑菌效果较好。

本试验筛选的鸡源唾液乳杆菌是健康鸡本身分离得到的菌株，耐酸好，对常见致病菌均有抑制作用，预期可作为微生态制剂用菌株，应用效果有待于在研究和生产实践中检验。

[1] 张刚.乳酸细菌——基础、技术和应用[M].北京:化学工业出版社,2007.

[2] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[3]雷正瑜.16SrDNA序列分析技术在微生物分类鉴定中的应用[J].湖北生态工程职业技术学院学报,2006,4（1）:4-7.

[4] 武香玉,陈存社.微生物絮凝剂产生菌的筛选鉴定[J].中国酿造,2009（9）:79-82.

[5] 徐海燕,曹斌,杨军方.鸡源嗜酸乳杆菌的筛选[J].中国饲料,2006（19）:32-34.