张婉 李丽

摘 要：简述了SSR分子标记的基本原理和特点，从白菜种质资源遗传多样性分析、SRR指纹图谱的构建、杂交种纯度的鉴定、遗传图谱构建和分子标记在辅助育种上的应用等几个方面介绍了近年来白菜研究中SSR分子标记的研究进展及应用前景。

关键词：白菜；分子标记；SSR；遗传分析

引言

白菜（Brassica campestris L. ssp. Pekinensis）原产于我国北方，现广泛种植于全国的标志性蔬菜种类之一，分为结球白菜、不结球白菜两个亚种。由于不同的白菜品种之间可以进行天然的杂交，如隔离不当以至于品种之间混淆，形成了很多栽培亚种或变种，且现今大量的白菜新品种涌入市场，因此，品种差异的鉴定在蔬菜生产和使用中显得尤为重要。对于商用种子的品种鉴别，新品种登记测试以及资源种质遗传多样性分析，都非常需要发展一种高效、快速、准确和经济实用的品种鉴别方式[1]。近年来生化和分子标记技术的快速发展使得其在鉴别能力、速度及准确性方面都比传统的种植鉴别有明显的优势，并且这些技术已经应用于茄子、黄瓜、玉米、水稻等蔬菜作物种质资源的鉴定，指纹图谱的构建，分子标记辅助选择育种及杂交种纯度的检测。利用分子技术已经在白菜的研究中进行了遗传多样性的分析，SSR指纹图谱的构建，品种真实性的鉴定及纯度的检测等大量工作[2-4]。在新品种审定及新品种的品种权授予前需要进行DUS测试，确定该品种的特异性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和稳定性（Stability） ，由于在各项研究中运用了分子标记技术，大大减少了实际中对于白菜种子检测的工作量。

现阶段在蔬菜研究中应用较广泛的DNA分子标记主要包括扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、随机扩增的多态性 （random amplified polymorphic DNA，RAPD）、相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）、简单重复序列区间扩增多态性（ simple sequence repeats，SSR）。AFLP标记技术是基于PCR扩增基因组DNA限制性片段，目前在甘蓝、大白菜、番茄、马铃薯、黄瓜等蔬菜作物的品种纯度鉴定上得以应用，但由于其操作程序较复杂，成本较高，影响其在商业品种鉴定中的广泛使用。RAPD技术自建立以来就在蔬菜研究中得到广泛的应用[5]，然而对于栽培品种之间真实性鉴别，其多态性频率相对较低，实验重复性较差，影响其在品种鉴定中广泛应用。SRAP是一种新型的基于PCR的标记系统，最早是在芸薹属作物开发出来。SSR分子标记技术通过设计引物进行SSR的多态性分析的方法已在植物中得到较广泛的应用。本文对于应用较广泛的SSR分子标记技术在白菜品种鉴定中的研究及应用现状进行了概述，为今后的白菜研究工作提供一定的参考。

1 SSR分子标记的基本原理和特点

SSR也叫微卫星DNA，一般由几个核苷酸（2-5bp）序列简单串联成重复序列，根据微卫星序列两端的保守序列设计特异性引物，通过PCR反应扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳检测得到的扩增片段，从而来揭示其多态性。SSR具有以下几个特点：（1）一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；（2）呈共显性遗传，可用来对杂交种进行纯度检测；（3）实验所需DNA量较少，且操作简单，实验重复性好，结果可靠性高；（4）数量丰富，且均匀覆盖整个染色体组。与其他分子标记技术相比，SSR标记在遗传多样性分析和品种鉴定上的优势显而易见，重要的是可以选特定的染色体上特定位置的SSR标记进行种质资源的鉴定和杂交种纯度的检测。

2 白菜种质资源遗传多样性的分析

分子标记在种质资源遗传多样性的研究中是一种有效的技术手段，目前，主要应用在遗传多样性分析中的分子标记技术有AFLP、ISSR和SSR标记等[6-7]，其中SSR标记以其丰富的多态性被广泛应用于蔬菜作物品种的遗传多样性的分析中。杨华[8]等利用SSR分子标记技术，对17份甘蓝、44份白菜，共61份芸薹属蔬菜进行遗传多样性分析，结果显示，所有材料被分为甘蓝和白菜两大类，其中白菜类品种的遗传相似系数在0.96～0.77之间，甘蓝类品种相似系数在0.93～0.63之间。并且作者还通过SSR分子标记技术与农艺性状鉴定相结合的方法来进行芸薹属蔬菜的多样性的分析，弥补了单一农艺性状鉴定上的不足之处，使之更加准确可靠。另外，在ISSR标记分析遗传多样性方面，杜黎明[9]等利用ISSR分子标记法，用11个具有高多态性引物对65个白菜样品进行PCR扩增，共扩增出107条谱带，其中多态性位点102个。对结果进行遗传多样性的分析，遗传相似系数在0.40-0.65之间。聚类分析结果表明，能将65个白菜品种划分为4大类，并表现出大部分种质资源关系与其来源地有一定的相关性。张波[10]对不结球白菜晚抽薹分子标记及抽萎性的遗传多样性进行了分析研究，研究表明，利用的RAPD、SSR，ISSR、SRAP多种分子标记手段进行遗传分析，最后仅从SSR引物中得到一条引物DBCl6与晚抽薹基因紧密连锁，其遗传距离为5.7cM，其余分子标记方式则均未发现与晚抽薹基因紧密连锁的分子标记。王笑一[11]等在用20对SSR引物建立80个小白菜品种的指纹图谱的前提下，并对其进行了遗传特异性分析，聚类分析表明，87.50% 的品种具有遗传特异性。

3 SSR指纹图谱的构建和杂交种纯度的鉴定

现阶段我国对于白菜种质资源主要通过农艺性状和形态表型进行鉴定的，由于鉴定周期较长，性状差异不明显，且受环境影响较大，从而难以将不同种质资源完全区分开来。品种间无论从形态、生理和生化上的区别，其实都是DNA水平上的差异，所以运用分子标记技术是通过直接分析遗传多态性从DNA水平上来鉴定品种间差异。SSR由于具有高多态性和可重复性，是应用于蔬菜作物类品种间鉴定及杂交种纯度的鉴定较广泛的分子标记技术之一，李丽[1]等开发了由3个引物对组成的6套EST-SSR复合标记组合，并完成了43个白菜品种的鉴别和大白菜品种差异的检测，验证了其EST-SSR复合标记能代表白菜品种间的多态性、品种内一致性、稳定性和重复性，并且可以高效准确的对白菜和大白菜品种的真实性和杂交纯度进行鉴别。

白菜杂交种是由独立的两个自交系杂交组配形成的，这两个自交系均可独立地与其他许多自交系组配，对于有些优良的自交系，其使用频率极高，所以造成大量品种都是同父异母或同母异父，其品种间的特异性鉴定更加困难。相比传统的品种鉴定技术，SSR分子指纹技术是对新品种审定和检测品种唯一性、一致性及稳定性的一种较有效的分子技术方法。虽然不能仅用其作为直接判定品种具有特异性的依据，但可以通过分子技术形成的品种SSR指纹图谱数据信息筛查出与之近似的品种，然后将新申请的品种与近似品种田间并排种植，进行形态DUS测试，从而达到对新品种鉴定的目的。目前黄瓜、柑橘、玉米、小麦等作物已经构建了SSR指纹图谱运用在品种鉴定方面。虽然目前白菜在构建SSR指纹图谱数据这方面鲜有报道，王笑一[11]等已经从131对SSR引物中筛选了2O对多态引物组合，对80个品种进行了分析，利用其中5对引物Nal2E02、Nal2A08、Ni4D09、BRMS-269和BRMS-296的组合，可以将80个品种完全分开，从而构建了SSR指纹图谱。

4 遗传图谱构建和分子标记在辅助育种上的应用

随着现代分子生物技术的快速发展，从以往的利用杂种优势进行白菜品种的选育到现在的以分子标记作为白菜品种的一种有效的辅助育种手段[12]。其中SSR标记多态性高、共显性遗传、稳定和可重复性好，适合于对蔬菜作物进行遗传图谱的构建、QTL定位和作为辅助育种的手段，单晓政[13]等运用ISSR、RAPD、SSR、sRAP等分子标记来构建不结球白菜分子遗传连锁图谱，分析结果表明构建的连锁图谱包含l1个连锁群，由139个标记组成，包括19个RAPD标记、22个SSR标记、4个ISSR标记和94个SRAP标记。另外，原玉香[14]等利用SRAP、SSR、AFLP、STS、ESTP和CAPS等多种分子标记和形态标记，以大白菜晚抽薹DH系Y177-12和早抽薹DH系Y195-93为亲本建立的183个DH系为作图群体构建了大白菜遗传图谱，为不同图谱的比较与整合及重要农艺性状的基因定位奠定基础。张明科[15]等利用231个多态性标记，以紫菜薹和结球白菜杂交的F2群体为材料，建立了包含163个标记、11个连锁群和4个片段的大白菜分子连锁图谱，其中包括117个RSAP标记、38个SRAP标记、5个SSR标记和3个RAPD标记。通过对图谱的分析，该图谱可有效的用于紫色等性状的QTL定位分析。Yuefei Li[16]等，利用71个SSR标记、145个SRAP标记建立了黄芯白菜的分子链锁图谱，平均遗传距离为3.8cm，分析结果显示，有3个QTLs控制了白菜黄芯的性状表现，40%发生了表型变异。

其中抗病育种是白菜育种者长期关注的问题之一，分子标记技术在大白菜抗病育种中也进行了一定量的研究。彭海涛[17]等利用群体分离分析法（BSA法）和SSR标记进行与不结球白菜抗芜菁花叶病毒（TuMV）基因连锁标记的筛选。通过SSR引物筛选，得到54对在双亲间稳定表现多态性的引物。其中1个与芜菁花叶病毒抗病基因连锁的SSR标记Ra3E05，连锁距离为8.7cm，根据测序结果重新设计引物，用F：群体对其验证，带型与原SSR标记表现一致，可用于分子标记辅助育种。

5 问题与展望

综上所述，目前在遗传多样性的分析、品种真实性和纯度的鉴定以及在育种方面的研究中，SSR分子标记与其他分子标记类型相比，以其独特的优势在白菜的分子水平上的研究有着极大的应用价值及潜力。但与棉花、水稻、玉米等作物在分子标记方面的研究相比，都存在较大的差距，同时也具有较大的研究空间。在白菜需要审定和登记的新品种日益增多的情况下，对于其品种真实性及纯度的鉴定上，SSR分子指纹技术具有重要的应用前景。现阶段在这方面还鲜有报道，所以构建白菜的指纹图谱数据库对于品种鉴定是一种重要的分子技术手段，并与原有的形态DUS测试系统是相融合的。在白菜分子标记辅助育种方面，对白菜进行遗传多样性的分析和遗传图谱的构建可以使育种者清楚的了解到种质资源的遗传背景，再根据其育种要求进行改造和创新，培育出品质优良、抗逆性显著及抗病虫害较强的新品种，是我国育种者当前比较重要的工作。

参考文献

[1]李丽，郑晓鹰.用于白菜和大白菜品种鉴定的EST-SSR复合标记的建立.园艺学报.2009，36（11）：1627-1634

[2]刘文，萧凤回，武剑，徐东辉，王晓武.大白菜和白菜群体的遗传结构分析.云南农业大学学报.2011，26（2）：156-163

[3]张明科，张鲁刚，巩振辉，惠麦侠.大白菜分子连锁图谱的构建与分析.分子植物育种.2009，7（1）：82-88

[4]李丽，郑晓鹰.AFLP分子标记应用于白菜品种鉴定.分子植物育种.2006，4（5）：685-689

[5]宋顺华，郑晓鹰.利用RAPD标记鉴定大白菜杂交种纯度的研究.华北农学报.2000，15（4）：35-39

[6]郭晶心，周乃元，马荣才，曹鸣庆.白菜类蔬菜遗传多样性的AFLP分子标记研究.农业生物技术学报.2002，10（2）：138-143

[7]虞慧芳，钟新民，陶跃之，唐侃，李必元.结球白菜种质遗传多样性和亲缘关系的AFLP分析.浙江农业学报.2008，20（5）：318-321

[8]杨华，刘灶长，陈海荣，陈亮，罗利军.上海地区芸薹属蔬菜遗传多样性研究.植物遗传资源学报.2006，7（3）：264-269

[9]杜黎明，胡天华，包崇来，朱琴妹，胡海娇，毛伟海.白菜种质遗传多样性与亲缘关系的ISSR标记分析.中国农学通报.2009，25（11）：20-24

[10]王笑一，于拴仓，张凤兰，余阳俊，赵岫云，张德双.小白菜品种的SSR指纹图谱及遗传特异性分析.华北农学报.2008，23（5）：97-103

[11]张波.不结球白菜晚抽薹分子标记及抽萎性的遗传分析.2007，硕士论文，PP63

[12]Wanxing Wang， Shunmou Huang， Yumei Liu， Zhiyuan Fang， Limei Yang， Wei Hua， Suxia Yuan，Shengyi Liu， Jifeng Sun， Mu Zhuang， Yangyong Zhang and Aisong Zeng. Construction and analysis of a high-density genetic linkage map in cabbage （Brassica oleracea L. var. capitata）. BMC Genomics 2012， 13：523，PP12

[13]单晓政，李英，高素燕，马成英，刘同坤，朱玉英，侯喜林.不结球白菜分子遗传图谱的构建及分析.西北植物学报.2009，29（6）：1116-1121

[14]原玉香，张晓伟，孙日飞，王晓武，张慧，蒋武生，姚秋菊，耿建峰.大白菜遗传图谱的构建及与染色体关联分析.华北农学报.2010，25（3）：80-86

[15]张明科，张鲁刚，巩振辉，惠麦侠.大白菜分子连锁图谱的构建与分析.分子植物育种.2009，7（1）：82-88

[16]Yuefei Li，Zhiyong Liu，Yushu Wang，Ning Yang，Xifeng Xin，Shuo Yang，Hui Feng. Identification of quantitative trait loci for yellow inner leaves in Chinese cabbage（Brassica rapa L. ssp. pekinensis） based on SSR and SRAP markers. Scientia Horticulturae .2012，133 ：10-17

[17]彭海涛，宋小明，侯喜林，李英.不结球白菜抗芜菁花叶病毒基因的遗传分析及SSR标记.江苏农业学报.2012，28（2）：396-401

作者简介：张婉（1986.4-），女，在读硕士，研究方向：植物分子生物学。

李丽（1963.6-），女，硕士，职称：高级农艺师，研究方向：利用分子标记进行杂交种纯度及品种真实性鉴定。

通讯作者：李丽

*通讯作者：lili@nercv.org