魏婷，梁喆，金彦，张丽

[摘要] 目的：利用免疫荧光化学染色法和Western blot法分别定性、定量地检测不同浓度的小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对稳定转染在HEK-293细胞中HERG钾通道表达的影响，以及不同浓度的小檗碱对大鼠心肌组织I_Kr通道蛋白表达的影响，探讨小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱的抗心律失常机制。方法：Western blot法检测HERG-HEK细胞上HERG通道蛋白的表达；免疫荧光化学染色法并利用共聚焦显微镜定性测定不同浓度的小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对HERG通道蛋白表达的影响；Western blot法定量检测不同浓度的小檗碱对大鼠心肌组织I_Kr通道蛋白表达的影响以及小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对稳定转染在HEK-293细胞中HERG钾通道蛋白表达的影响。结果：Western blot法检测稳定转染有HERG基因的HEK293细胞能高水平的表达HERG通道蛋白。10，30 μmol·L^-1的小檗碱明显抑制HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达（P<0.01）。10，20 mg·kg^-1的小檗碱抑制大鼠心肌组织I_Kr通道蛋白的表达（P<0.05）。3，10，30 μmol·L^-1的莲心碱促进HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达（P<0.05）。甲基莲心碱不影响HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达。结论：稳定转染的HERG-HEK细胞能高水平的表达HERG通道蛋白；小檗碱对体外HERG-HEK细胞和大鼠心肌组织I_Kr通道的蛋白表达均有抑制作用；莲心碱促进HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达；甲基莲心碱对HERG通道蛋白表达无影响。

[关键词] 小檗碱；莲心碱；甲基莲心碱； HERG通道；心律失常

HERG基因 （human ether a-go-go-related gene） 编码心脏快速激活延迟整流钾电流I_Kr的α亚基，该基因调控I_Kr通道，在心肌细胞的复极化过程中发挥重要作用。研究表明，HERG通道既是抗心律失常药物作用的最佳靶点也是产生致命性心律失常的分子靶点。HERG缺陷可引起先天性长QT综合症（LQTS）[1]，同时某些药物通过阻断该通道、抑制HERG的蛋白表达可引起获得性LQTS[2-3]。异喹啉类生物碱小檗碱（berberine，Ber）、莲心碱（liensinine，Lie）、甲基莲心碱 （neferine， Nef）对心血管系统具有多种药理作用，在对抗多种实验性心律失常方面效果显著。本实验采用细胞培养以及分子生物学技术初步研究小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对HERG通道蛋白表达的影响，并进一步分析其抗心律失常的分子、离子机制及其是否引起LQTS的副作用，为更深一步研究药物作用位点及其与通道的构效关系、有效治疗LQT综合征及其他相关的心律失常奠定基础。

1 材料

1.1 药物与试药 小檗碱购自中国食品药品检定研究院；莲心碱、甲基莲心碱购自中山康之源科技有限公司；胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所；DMEM培养基购自Hyclone公司；抗HERG的多克隆抗体（兔、山羊）购自Santa Cruz生物技术公司；红外荧光标记的二抗（Alexa Fluor 488， Alexa Fluor 700，Alexa Fluor 680）购自Molecular Probes公司。

1.2 细胞 HEK293细胞购于中国协和医科大学，稳定转染有 HERG通道的HEK293细胞由加拿大蒙特利尔心脏研究中心王志国教授惠赠。

1.3 仪器 IX-70相差倒置显微镜（Olympus公司）；荧光显微镜及彩色照相系统（日本尼康公司）；Odyssey红外荧光扫描系统（LI-COR公司）；MiniRun GE-100凝胶电泳仪；电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 HERG-HEK细胞培养于含有10%胎牛血清和400 μmol·L^-1G418的DMEM培养基中，HEK293细胞培养于上述不含G418的培养液中，37 ℃，5%CO2₂ 饱和湿度孵箱培养。经过消化传代，取处于对数生长期的细胞进行培养。

2.2 免疫细胞荧光染色检测小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对HERG蛋白表达的影响 取对数生长期的HERG-HEK细胞稀释至铺有盖玻片的6孔板中培养。待细胞爬片贴壁后，分别以空白培养基和含终浓度为1，3，10，30 μmol·L^-1的小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱的培养基孵育HERG-HEK细胞48 h，依次进行固定、穿透、封闭[4]，一抗（抗HERG的兔抗体，1∶200）4 ℃孵育过夜，复温后用PBS冲洗3次，每次5 min，加入FITC标记的羊抗兔二抗 （1∶200），避光室温反应2 h。用PBS冲洗3次后利用激光共聚焦显微镜观察。

2.3 Western blot检测小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对稳定转染有HERG基因的HEK293细胞中HERG蛋白表达的影响 将处于对数生长期的HERG-HEK细胞分别以空白培养基和含终浓度为1，3，10，30 μmol·L^-1的小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱的培养基孵育48 h（24 h更换1次含有上述药物的新鲜培养基）。用预冷的PBS收集细胞并提取总蛋白，用Brad-ford法进行蛋白定量。取等量样品，加入等体积的5×上样缓冲液后，煮样、电泳、转膜、封闭[4]，加入一抗（抗HERG的兔抗体，1∶200），室温孵育1.5 h，用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次15 min，然后用红外荧光标记二抗（羊抗兔Alexa Fluor 700二抗，1∶4 000）对膜室温避光孵育1 h，用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次15 min，再用PBS洗膜15 min，洗去聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯（Tween-20）以降低背景，以上过程均需避光。洗膜后用Odyssey红外荧光扫描系统检测，以GAPDH作内参，用图像分析软件Scion Image进行吸光度积分值分析。

2.4 Western blot检测小檗碱对大鼠心肌组织I_Kr通道蛋白表达的影响 将大鼠分为空白对照组，5，10，20 mg·L^-1加药组，分别尾静脉注射生理盐水和相应浓度的小檗碱溶液，24 h后，取心肌组织并提取组织膜蛋白，测定膜蛋白浓度，放置于-80 ℃超低温冰箱中待用。取等量样品，加入等体积的5×上样缓冲液后，煮样、电泳、转膜、封闭[4]，加入一抗（多克隆羊抗体1∶200），室温孵育1.5 h，用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次15 min，然后用红外荧光标记的二抗（驴抗山羊IgG Alexa Fluor 680，1∶4 000），避光孵育1 h，用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次15 min，再用PBS洗膜15 min，洗去Tween-20以降低背景，以上过程均需避光。Odyssey红外荧光扫描成像系统对膜上蛋白质进行检测，用图像分析软件Scion Image进行吸光度积分值分析。

2.5 统计学处理 实验数据以 ±s表示，采用Students′t检验进行统计学检验。

3 结果

3.1 稳定转染的HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达 培养HEK293细胞及稳定转染的HERG-HEK细胞，提取总蛋白，用针对N末端的HERG通道蛋白的抗体作为一抗，通过Western blot 分析检测HERG通道蛋白的表达。实验结果显示HEK293细胞中没有HERG钾通道蛋白的表达，而HERG-HEK细胞中存在HERG钾通道蛋白的表达，并且发现2条带（图1）。

3.2 小檗碱对HERG-HEK细胞中HERG蛋白表达的影响 分别用1，3，10，30 μmol·L^-1的小檗碱孵育HERG-HEK细胞24 h后进行Western blot检测，结果发现小檗碱（10，30 μmol·L^-1）显著抑制HERG钾通道蛋白的表达（P<0.01）（图2）。

与对照组相比1）P<0.05，2）P<0.01（图4，5同）。

通过免疫荧光染色法利用激光共聚焦显微镜观察，小檗碱（10，30 μmol·L^-1）孵育后细胞膜上的荧光强度明显低于对照组，与Western blot的结果相一致（图3）。

3.3 小檗碱对大鼠心肌组织中HERG蛋白表达的影响 分别用生理盐水，5，10，20 mg·kg^-1的小檗碱溶液尾静脉注射大鼠，24 h后取心肌组织提取组织膜蛋白，进行Western blot分析。结果显示，小檗碱（10，20 mg·kg^-1）可以抑制HERG钾通道蛋白的表达（P<0.05） （图4）。

3.4 莲心碱对HERG-HEK细胞中HERG钾通道蛋白表达的影响 分别用1，3，10，30 μmol·L^-1的莲心碱孵育HERG-HEK细胞24 h后进行Western blot检测，结果发现莲心碱（3，10，30 μmol·L^-1）可以促进HERG钾通道蛋白的表达（P<0.05）（图5）。

通过免疫荧光染色法利用激光共聚焦显微镜观察，发现高亮度绿色荧光位于细胞膜上，细胞浆中特异性绿色荧光微弱，提示HERG钾通道蛋白主要定位在细胞膜上，并且莲心碱（3，10，30 μmol·L^-1）孵育后细胞膜上的荧光强度明显高于对照组，与Western blot的结果相一致（图6）。

3.5 甲基莲心碱对HERG-HEK细胞中HERG钾通道蛋白表达的影响 用含有不同浓度的甲基莲心碱的培养液孵育HERG-HEK细胞24 h后，进行Western blot分析。结果显示，各组之间均无显著性差异（图7）。

免疫荧光结果显示各组之间荧光亮度无明显差异，与Western blot的结果相一致（图8）。

4 讨论

HERG是钾通道的编码基因，它所表达的离子通道正是多数Ⅲ类抗心律失常药的作用靶点[5]，其生物物理学特性及药理学特性与I_Kr相似。研究发现，某些抗心律失常药物以及非抗心律失常药物均可通过阻断HERG通道使患者心电图上出现QT间期延长的表现，严重者甚至可以引起猝死[6-7]，其中抗疟原虫药pentamidine是通过影响HERG通道的蛋白表达而引发心律失常的[8]。由此可见，HERG通道既是抗心律失常药物作用的最佳靶点也是产生致命性心律失常的分子靶点，因此通过对HERG通道的研究将有助于开发更安全、高效的抗心律失常药物。

4.1 小檗碱对HERG通道的影响 小檗碱对心脏有正性肌力和负性频率作用，可以对抗哇巴因、氯化胆碱和氯化钙等药物以及冠脉结扎、缺血-再灌注等所致的大鼠实验性心律失常[9]，临床上小檗碱对室性、室上性心律失常有较好的治疗作用。近期还发现小檗碱对大鼠心肌肥厚模型也有改善作用[10]，这些都说明小檗碱抗心律失常的分子靶点是多方面的。研究表明，小檗碱可以作用于HERG钾通道，显著延长动作电位时程，并抑制HERG钾通道电流[11]，并有文献进一步研究了小檗碱作用于HERG钾通道的分子位点[12]，说明小檗碱对HERG通道的影响很可能是其抗心律失常的作用机制之一。

本实验使用针对N末端的HERG通道蛋白抗体作为一抗，经Western blot分析，发现存在2条带，其中155 kDa的蛋白为HERG通道完全糖基化形式，即该通道的成熟形式，主要定位于细胞膜上；而135 kDa的蛋白为HERG通道核心糖基化的形式，即成熟通道的前体，主要存在于内质网和高尔基复合体中[13]。HERG通道蛋白属于N连接糖蛋白，在细胞外的部分存在2个糖基化的位点 （N598，N629），研究表明N连接糖基化与HERG通道的稳定性有密切关系，控制蛋白质的折叠、运输、修饰、以及使其免受蛋白酶的降解[14]。

近年来研究证明某些药物不但对体外转染有HERG通道的细胞蛋白表达有作用，还对新生乳鼠体内的心肌细胞HERG蛋白表达有一定作用[15]，为从体外体内2个方面验证药物对HERG通道的作用奠定了基础。本实验从蛋白水平上研究了小檗碱对HERG钾通道表达的影响，体外HERG-HEK细胞和大鼠心肌组织的HERG蛋白表达结果均显示，小檗碱可以降低HERG钾通道蛋白的完全糖基化形式，抑制HERG钾通道膜蛋白的表达和成熟，从而从体内和体外2个方面确定了小檗碱对HERG通道蛋白表达的作用。但HERG-HEK细胞中10，30 μmol·L^-1组间以及大鼠心肌组织中10，20 mg·kg^-1组间统计均无明显差异，所以小檗碱对HERG钾通道膜蛋白的抑制作用没有明显的浓度依赖性。

本实验研究首次从蛋白水平上完善了小檗碱对HERG钾通道作用的全面研究，并初步分析了其抗心律失常的分子机制，为小檗碱的临床应用和安全性提供了理论依据。但小檗碱降低HERG钾通道完全糖基化蛋白的作用是否具有生理学功能还需进一步研究，从而可以更加系统和具体的阐明小檗碱抗心律失常的离子机制，为提高其临床应用价值提供理论依据。

4.2 莲心碱对HERG通道的影响 莲心碱是莲子心中的一种含量较高的酚性生物碱，现代研究表明其具有降压，减慢心率，抑制心肌收缩力，抗心律失常等作用[16]。莲心碱能减慢心率， 使心室舒张期延长， 有利于血液从心外膜区向内膜区灌注， 改善缺血缺氧；抑制心肌收缩， 降低后负荷，从而降低了心肌耗氧量，有利于抗心律失常作用发挥[17]。莲心碱对心肌慢反应动作电位及慢内向电流有影响，10～100 μmol·L^-1可浓度依赖性降低离体兔窦房结起搏细胞慢反应动作电位幅度及零相最大上升速率，延长窦性周长，同浓度下， 其作用强于奎尼丁；莲心碱1～100 μmol·L^-1可浓度依赖性抑制犬浦肯野氏纤维慢向内流；莲心碱还可对抗乙酰胆碱缩短动作电位时程的作用， 这些都提示莲心碱对Na+ ，K+ ，Ca2 +的跨膜转运均有抑制作用[18-19]。

本实验研究中Western blot的结果为经过3，10，30 μmol·L^-1莲心碱处理HERG-HEK细胞48 h后HERG通道完全糖基化的形式即成熟HERG通道的表达明显增加，同时，免疫荧光化学染色结果显示细胞膜上的荧光强度明显增强，说明定位在细胞膜上的成熟的HERG通道蛋白增加了，即中高浓度的莲心碱可以促进HERG通道蛋白在细胞膜上的表达和成熟，这就避免了因长时间应用莲心碱所引起的LQTS副作用，并且可以弥补由于HERG通道被阻断而引起的相对不足，提示中高浓度的莲心碱可以成为潜在的治疗LQTS的药物之一。通过对HERG通道蛋白核心糖基化形式的分析发现各组之间没有显著性差异，说明莲心碱在蛋白的运输过程中起作用，但其影响蛋白的修饰加工、运送至细胞膜的一步或几步还有待进一步研究。

4.3 甲基莲心碱对HERG通道的影响 本实验用不同浓度甲基莲心碱作用于稳定转染的HERG-HEK细胞，Western blot和免疫荧光化学染色的结果均显示甲基莲心碱对HERG通道蛋白的表达无明显影响，说明甲基莲心碱不会阻碍HERG通道蛋白的生成与转运，为甲基莲心碱的安全性提供了理论支持，但其具体电生理学方面的机制还有待于进一步完善。

从莲心碱和甲基莲心碱对HERG通道蛋白的表达的影响中可以看出，在3，10，30 μmol·L^-1的莲心碱作用下，HERG蛋白表达的量是增加的，但是缺乏剂量依赖性，而甲基莲心碱作用后，HERG蛋白表达的量无明显改变。可能是由于甲基莲心碱比莲心碱多一个甲基，从而改变了药物分子的极性，稳定性，也因此改变了其作用机制及疗效。

综上所述，稳定转染有HERG基因的HEK293细胞能高水平的表达HERG通道蛋白。10，30 μmol·L^-1的小檗碱显著抑制稳定转染的HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达，但无明显剂量依赖性。10，20 mg·kg^-1的小檗碱抑制大鼠心肌组织I_Kr通道蛋白的表达。3，10，30 μmol·L^-1的莲心碱促进稳定转染的HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达，但无明显剂量依赖性。甲基莲心碱不影响稳定转染的HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达。

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Effect of berberine， liensinine and neferine on HERG channel expression

WEI Ting*， LIANG Zhe， JIN Yan， ZHANG Li

（Harbin Children′s Hospital， Harbin 150010， China）

[Abstract] Objective： Immunofluorescence and Western blot methods were adopted for qualitative and quantitative detections of the effect of different concentrations of berberine， liensinine and neferine on the expression of stable transfection in HERG potassium channel in HEK-293 cells， as well as the effect of different concentrations of berberine on protein expression of I_Kr channel in cardiac muscular tissues， in order to investigate the anti-arrhythmic mechanism of berberine， liensinine and neferine. Method： Western blot method was used to detect protein expression of HERG channel in HERG-HEK cells. Immunofluorescence method as well as confocal laser microscope were used to detect the effect of different concentrations of berberine， liensinine and neferine on protein expression of HERG channel. Western blot method was used to detect the effect of different concentrations of berberine on protein expression of I_Kr channel in cardiac muscular tissues as well as the effect of berberine， liensinine and neferine on protein expression of stable transfection in HERG potassium channel in HEK-293 cells. Result： Western blot experiment manifested that stable transfection of HEK293 cells containing HERG genes could increase protein expression of HERG channel. Berberine （10， 30 μmol·L^-1） remarkably inhibited protein expression of HERG channel in HERG-HEK cells （P<0.01）. Berberine （10， 20 mg·kg^-1） also inhibited protein expression of I_Kr channel in rat ventricular tissues （P<0.05）. Liensinine （3， 10， 30 μmol·L^-1） increased protein expression of HERG channel in HERG-HEK cells （P<0.05）. Neferine showed no effect on protein expression of HERG channel in HERG-HEK cells. Conclusion： The stably transfection of HERG-HEK cells can increase protein expression of HERG channel. Berberine shows inhibitory effect on protein expressions of in vitro HERG-HEK cells and I_Kr channel in rat ventricular tissues. Liensinine improves protein expression of HERG channe in HERG-HEK cells. Neferine shows no effect on protein expression of HERG channel.

[Key words] berberine； neferine； liensinine； HERG channel； arrhythmia

doi：10.4268/cjcmm20130219

[责任编辑 张宁宁]