姚士，徐乃玉，褚纯隽，张健，陈道峰

[摘要] 目的：在前期研究基础上，深入研究蓝萼香茶菜的化学成分及其抗补体活性。方法：通过溶血试验，对蓝萼香茶菜各部位进行抗补体活性测试，以抗补体活性作为导向分离手段，运用多种色谱方法分离纯化蓝萼香茶菜中的化学成分，采用现代谱学技术进行结构鉴定，确定抗补体活性成分。结果：蓝萼香茶菜的正丁醇部位活性较强，从蓝萼香茶菜中分离得到11个化合物，分别为豆甾醇（1），豆甾醇-9（11）-烯-3-醇（2），蓝萼丁素（3），尾叶香茶菜丙素（4），山楂酸（5），科罗索酸（6），minheryinsⅠ（7），香叶木素（8），咖啡酸乙烯酯（9），咖啡酸（10），牡荆苷（11）。抗补体活性实验表明，化合物9，10以及前期分离得到的异槲皮苷、芦丁、槲皮素、槲皮素-3-甲醚、木犀草素、木犀草素-7-甲醚和芹菜素对经典途径的补体激活具有不同程度的抑制作用。结论：化合物2，4，6～9，11为首次从该植物中获得，咖啡酸的抗补体活性最强，CH₅₀为0.041 g·L^-1。

[关键词] 蓝萼香茶菜； 化学成分； 咖啡酸乙烯酯； 抗补体活性

蓝萼香茶菜为唇形科香茶菜属植物，分布于中国东北、华北和吉林省长白山地区，资源极为丰富，蓝萼香茶菜有抗菌消炎和抗癌活性，用于胃炎、肝炎初起、感冒发热、乳腺炎、关节痛等疾病[1]。在前期工作中本课题组对蓝萼香茶菜的化学成分进行研究，分离得到芹菜素等化合物[2-3]，体外抗溶血实验表明该植物的正丁醇部位具有抗补体活性，为了深入研究其抗补体活性成分并为进一步开发利用该药材奠定基础，本文分离得到11个化合物，通过NMR，MS等手段鉴定了其结构，并对从蓝萼香茶菜中得到的部分化合物进行抗补体活性筛选。结果表明化合物9，10以及前期分离得到的异槲皮苷，芦丁，槲皮素，槲皮素-3-甲醚，木犀草素，木犀草素-7-甲醚，芹菜素对经典途径的补体激活具有抑制作用，其中咖啡酸的抑制作用最强，50%抑制溶血浓度（CH₅₀）为0.041 g·L^-1。

1 材料

2051型紫外-可见分光光度仪；Nicolet Impact 410型红外光谱仪；HP5989A质谱仪；Brucker ACF-300，400型核磁共振仪；制备液相，包括慧德易QuikSep高压泵，慧德易QuikSep检测器；YMC色谱柱（20 mm×250 mm，5 μm）。Sephadex LH-20为GE Healthcare产品，Amberchrom CG161M为慧德易公司分装ROHMHAAS型。薄层色谱和柱色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂产品，高效薄层色谱板为烟台市化学工业研究所烟台化工科技开发实验厂产品，所用试剂均为分析纯。

药材采自黑龙江省铁力市桃山林业局白河林场，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为蓝萼香茶菜Rabdosia japonica var. glaucocalya（Maxim.）Hara，标本保存在黑龙江中医药大学标本馆。

豚鼠（200～250 g），雌雄不限，复旦大学实验动物部提供[合格证编号SCXK（泸）2009-1038]。绵羊红细胞（SRBC）和溶血素由复旦大学药理教研室章蕴毅副教授提供。

2 方法

2.1 提取分离

蓝萼香茶菜地上部分50 kg，以95%乙醇提取3次，提取液浓缩，得流浸膏10 L，将其溶解在水中，经石油醚萃取脱脂，再分别以三氯甲烷、正丁醇依次萃取，得相应萃取物为600，960 g。

三氯甲烷萃取物经硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇（100∶0～2∶1）进行梯度洗脱，得到8个部分。Fr.2经硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇（100∶1～80∶1）洗脱，得到化合物1（12 mg），2（21 mg）；Fr.6经三氯甲烷重结晶得到化合物3（40 mg），母液回收三氯甲烷后残渣再用三氯甲烷-甲醇（4∶1）结晶得到化合物4（60 mg）；Fr.7采用液相制备，以80%甲醇作为流动相，流速为5 mL·min^-1，进样量200 μmL，柱温为25 ℃，检测波长210 nm，得到化合物5（40 mg，tR 19.5 min），6（30 mg，t_R 21.2 min）；Fr.8经硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脱得到化合物7（80 mg）。

正丁醇部分采用硅胶柱色谱，用三氯甲烷-甲醇系统（100∶7～10∶1）洗脱得到Fr.1～ Fr.4。Fr.1经Sephadex LH-20柱色谱，甲醇洗脱，分为Fr.1-1和Fr.1-2。Fr.1-1用甲醇重结晶得化合物8（30 mg），Fr.1-2装入Amberchrom CG161M树脂柱，用水，30%，60%，90%甲醇洗脱，30%甲醇洗脱部分得到化合物10（40 mg），60%甲醇洗脱部分得化合物9（60 mg）；Fr.2采用硅胶柱色谱，经三氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脱后分为Fr.2-1，Fr.2-2和Fr.2-3，Fr.2-2继续用Sephadex LH-20柱色谱，甲醇洗脱，得化合物11（60 mg）。

2.2 补体经典途径的溶血活性（CH₅₀）测定[4]

2.2.1 溶液配制 巴比妥缓冲液（BBS），包含0.5 mol·L^-1镁（Mg2+）和0.15 mol·L^-1钙（Ca2+）。按实验需要用巴比妥缓冲液配制成1∶1 000溶液，作为溶血素。

2.2.2 补体的效价测定 取一定量豚鼠血清（补体）配成1∶10溶液，并对倍稀释成1∶20，1∶40，1∶80，1∶160。取溶血素、各溶度补体及2% SRBC各0.1 mL溶于0.3 mL BBS中，混匀，37 ℃水浴温育30 min，离心后取上清液在405 nm处测定吸光度。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，选择达到相似吸光度的最低补体溶度作为正常溶血所需的临界补体溶度。

2.2.3 药物经典途径抗补体活性测定 取临界浓度的补体分别与不同浓度的供试品混匀，加入适量的BBS、溶血素和2% SRBC。37 ℃水浴温育30 min，离心后取上清液在405 nm处测定吸光度。实验同时设置对照组和全溶血组。以供试品浓度作为X，以供试品组扣除对照组吸光度计算溶血抑制率作为Y，计算CH₅₀。

3 结果

3.1 结构鉴定

化合物1 白色针晶（氯仿）；与文献[5]报道豆甾醇的数据一致。

化合物2 白色无定形粉末；¹H-NMR（CDCl₃，400 MHz）δ： 5.35（1H，m，H-11），3.52（1H，m，H-3），0.68（3H，s，H-18），1.00（3H，s，H-19），0.82（3H，d，J=6.0 Hz，H-21），0.89（3H，d，J=6.0 Hz，H-26），0.85（3H，d，J=6.0 Hz，H-29）； ¹³C-NMR（CDCl₃，100 MHz）δ： 31.8（C-1），32.1（C-2），72.0（C-3），39.9（C-4），42.6（C-5），24.5（C-6），28.4（C-7），37.4（C-8），140.9（C-9），36.7（C-10），121.9（C-11），42.5（C-12），46.0（C-13），56.2（C-14），23.2（C-15），21.2（C-16），56.9（C-17），12.1（C-18），18.9（C-19），36.3（C-20），19.2（C-21），34.1（C-22），29.9（C-23），50.3（C-24），29.3（C-25），20.0（C-26），19.6（C-27），26.2（C-28），12.0（C-29）。以上数据与文献[6]报道豆甾醇-9（11）-烯-3-醇的数据一致。

化合物3 白色针晶（三氯甲烷）；¹H-NMR（CDCl₃，300 MHz）δ： 5.45（1H，s，H-17a），6.18（1H，s，H-17b），5.42（1H，dd，J=11.6，4.4 Hz，H-7），4.83（1H，s，H-14），1.14（3H，s，H-18），1.06（3H，s，H-19），1.07（3H，s，H-20）； ¹³C-NMR（CDCl₃，75 MHz）δ： 38.1（C-1），33.5（C-2），216.6（C-3），46.7（C-4），51.0（C-5），26.5（C-6），74.2（C-7），61.1（C-8），53.3（C-9），38.9（C-10），18.6（C-11），30.8（C-12），45.7（C-13），75.7（C-14），204.7（C-15），146.6（C-16），118.7（C-17），28.0（C-18），20.8（C-19），18.1（C-20），168.3（-CO），21.3（-CH3）。以上数据与文献[7]报道蓝萼丁素的数据一致。

化合物4 白色针晶（甲醇）；m/z 389 [M+K]+； ¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 3.51（1H，d，J=9.4 Hz，H-1），1.71（1H，m，H-2），5.33（1H，s，H-17a），6.04（1H，s，H-17b），0.86（3H，s，H-18），0.85（3H，s，H-19），4.06（1H，d，J=12.0 Hz，H-20a），3.85（1H，d，J=12.0 Hz，H-20b）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz）δ： 80.5（C-1），29.7（C-2），38.6（C-3），32.5（C-4），51.3（C-5），29.3（C-6），73.7（C-7），60.6（C-8），55.7（C-9），46.2（C-10），20.2（C-11），30.5（C-12），46.4（C-13），75.1（C-14），208.4（C-15），149.5（C-16），115.4（C-17），33.2（C-18），22.0（C-19），60.5（C-20）。以上数据与文献[8]报道尾叶香茶菜甲素的数据一致。

化合物5 白色无定形粉末；¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 1.08（3H，s，H-23），0.92（3H，s，H-24），0.82（3H，s，H-25），0.92（3H，s，H-26），0.92（3H，s，H-27），0.71（3H，s，H-29），0.75（3H，s，H-30），4.30（1H，s，H-2），5.17（1H，br s，H-12）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz ）δ： 45.7（C-1），67.1（C-2），82.2（C-3），38.9（C-4），54.8（C-5），18.1（C-6），32.9（C-7），46.8（C-8），47.1（C-9），37.7（C-10），23.4（C-11），121.4（C-12），143.9（C-13），41.3（C-14），27.2（C-15），22.6（C-16），45.4（C-17），23.0（C-18），40.8（C-19），30.4（C-20），33.3（C-21），32.3（C-22），28.8（C-23），16.3（C-24），16.9（C-25），17.1（C-26），25.7（C-27），178.6（C-28），32.8（C-29），22.9（C-30）。以上数据与文献[9]报道山楂酸的数据一致。

化合物6 白色无定形粉末；¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 1.04（3H，s，H-23），0.80（3H，s，H-24），0.91（9H，s，H-25～27），0.72（3H，d，J=6.3 Hz，H-29），0.72（3H，d，J=6.3 Hz，H-30），4.37（1H，s，H-2），5.13（1H，br s，H-12），2.73（1H，d，J=9.2 Hz，H-19）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz）δ： 46.8（C-1），67.1（C-2），82.2（C-3），37.6（C-4），54.7（C-5），18.0（C-6），32.6（C-7），41.7（C-8），47.1（C-9），37.5（C-10），23.0（C-11），124.5（C-12），138.3（C-13），41.7（C-14），27.5（C-15），23.8（C-16），47.0（C-17），52.4（C-18），38.5（C-19），38.5（C-20），30.2（C-21），36.3（C-22），28.8（C-23），17.2（C-24），16.5（C-25），17.0（C-26），23.3（C-27），178.3（C-28），21.1（C-29），17.0（C-30）。以上数据与文献[10]报道科罗索酸的数据一致。

化合物7 白色晶体（甲醇）；¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 1.00（3H，d，J=6.9 Hz，H-17），0.99（3H，s，H-18），0.75（3H，s，H-19），0.97（3H，s，H-20）；¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz）δ： 36.9（C-1），24.3（C-2），83.5（C-3），38.5（C-4），52.4（C-5），28.7（C-6），73.5（C-7），59.7（C-8），54.0（C-9），37.6（C-10），16.7（C-11），22.9（C-12），41.8（C-13），74.4（C-14），220.8（C-15），42.3（C-16），9.2（C-17），28.2（C-18），17.6（C-19），17.1（C-20），100.8（C-1′），73.9（C-2′），76.6（C-3′），70.1（C-4′），76.8（C-5′），61.3（C-6′）。以上数据与文献[11]报道minheryins I的数据一致。

化合物8 淡黄色粉末；¹H-NMR（DMSO-d₆，300 MHz）δ： 3.87（3H，s，4′-OCH3），6.89（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），7.42（1H，d，J=1.9 Hz，H-2′），7.45（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6′），6.37（1H，s，H-3），6.71（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.72（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），9～10（2H，br s，3′，7-OH），12.97（1H，s，5-OH）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，75 MHz）δ： 165.1（C-2），104.7（C-3），181.8（C-4），157.2（C-5），97.9（C-6），164.2（C-7），92.5（C-8），161.2（C-9），103.0（C-10），119.1（C-1′），113.5（C-2′），149.8（C-3′），145.8（C-4′），116.0（C-5′），121.4（C-6′），56.0（4′-OCH3）。以上数据文献[12]报道香叶木素的数据一致。

化合物9 淡黄色粉末；¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 7.10（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），6.78（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.97（1H，dd，J=2.0，8.2 Hz，H-6），7.63（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），6.34（1H，d，J=15.9 Hz，H-8），7.34（1H，dd，J=6.3，14.0 Hz，H-10），4.97（1H，d，J=14.0 Hz，H-11a），4.69（1H，d，J=6.3 Hz，H-11b）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz）δ： 125.3（C-1），115.1（C-2），145.6（C-3），149.0（C-4），115.8（C-5），121.9（C-6），147.4（C-7），112.1（C-8），163.8（C-9），141.4（C-10），97.9（C-11）。以上数据与文献[13]报道咖啡酸乙烯酯的数据一致。

化合物10 淡黄色粉末；IR（KBr，cm^-1）v： 3 500，2 500提示有（-COOH），（-OH），1 500～1 600为（-Ar）； ¹H-NMR（DMSO-d₆，300 MHz）δ： 7.42（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），6.17（1H，d，J=15.9 Hz，H-8），7.03（1H，s，H-2），6.76（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），6.97（1H，d，J=8.1 Hz，H-6）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，75 MHz）δ： 125.9（C-1），114.8（C-2），145.7（C-3），148.3（C-4），115.3（C-5），121.3（C-6），144.7（C-7），115.9（C-8），168.0（C-9）。以上数据与文献[14]报道咖啡酸的数据一致。

化合物11 黄色粉末；¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 13.18（1H，s，5-OH），8.03（2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，6′），6.89（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.79（1H，s，H-3），6.28（1H，s，H-6），4.68（1H，d，J=9.9 Hz，H-1″）。¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz）δ： 164.0（C-2），102.4（C-3），182.1（C-4），160.4（C-5），98.1（C-6），162.5（C-7），104.1（C-8），156.0（C-9），104.6（C-10），121.6（C-1′），129.0（C-2′，6′），115.8（C-3′，5′），161.1（C-4′），78.7（C-1″），73.4（C-2″），70.8（C-3″），70.6（C-4″），81.9（C-5″），61.3（C-6″）。以上数据与文献[15]报道牡荆苷的数据一致。

3.2 单体化合物的50%抑制溶血浓度

5批次不同稀释倍数豚鼠血清（补体）加入溶血体系中，评价其效价。在补体稀释溶度为1∶10～1∶80时，溶血率接近100%，体系基本达到全溶血，所以选择1∶80稀释的豚鼠血清作为经典途径筛选实验中所使用的补体浓度，将从香茶菜中得到的16个化合物进行体外抗补体活性测试，其中咖啡酸的活性最强，见表1。