李淑娟，唐一通

(1.延安大学西安创新学院，西安710100;2.湖北文理学院医学系，襄阳441053)

自从1868年瑞士青年科学家米歇尔在人体细胞中发现核酸以来，有关核酸研究的进展日新月异，针对疾病诊断、治疗和预防的核酸药物也应运而生［1］。由于其特异性强、作用效率高、免疫原性低、应用范围广等特点，正日益显示出重要作用，具有潜在临床应用前景。目前，已经上市或进入临床试验的核酸药物根据化学结构和药物机理可分为三类，分别是寡聚核苷酸药物、核酸适配体药物和核酸疫苗。

1 寡聚核苷酸药物

寡聚核苷酸药物包括反义核酸、核酶、脱氧核酶以及RNA干扰剂等。这类药物可以在细胞中专一性地降低目标基因表达水平，通常分子量较小，能够较容易透过细胞膜。

1.1 反义核酸

反义核酸是人工合成或天然存在的抑制或封闭基因表达的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术，该技术是一种新的药物开发方法，利用反义核酸技术研制的药物称为反义核酸药物，包括反义RNA和反义 DNA，通常是指反义寡核苷酸(ASODN)。反义核酸药物与传统药物的性质和作用对象明显不同，表现为:新的化学本质—核酸;新的药物受体——mRNA和双链 DNA;新的受体结合方式——Watson-Crick和Hoogsteen杂交;新的药物受体结合后反应等。此外，与传统药物主要是直接作用于致病蛋白本身相比，反义核酸药物作为直接作用于致病编码基因的治疗药物，具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点，可用于多种疾病的治疗，主要用于癌症和病毒感染。目前，反义核酸药物已在治疗癌症(如神经母细胞瘤、膀胱癌、多发骨髓瘤、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、胰腺癌等)、抗病毒(如HIV、HBV等)、精神疾病、自身免疫病(如牛皮癣、多发性硬化症、风湿性关节炎)、眼科疾病(如眼膜损伤修复、白内障、青光眼、增生性视网膜玻璃体病变)，心血管疾病(如高血压、冠心病、心脏移植后并发症、心力衰竭)中取得了一定的疗效［1-4］。许多研究表明Fas配体(FasL)、转录激活因子3(STAT3)及血管内皮生长因子(VEGF)等过表达与肿瘤生长和转移有关，因此以这些蛋白为靶点的药物已成为肿瘤治疗的研究热点。方丽［5］等设计合成针对FasL的ASODN，并用阳离子脂质体介导转染舌鳞癌细胞系Tca8113细胞，实验研究表明FasL ASODN对Tca8113细胞的增殖有一定的抑制作用，能够促进其凋亡，因此FasL的ASODN有望成为舌鳞癌潜在的基因治疗方法。孙兆翎［6］等研究了STAT3的ASODN对人宫颈癌HeLa细胞定植和侵袭功能的影响，结果表明STAT3基因的特异ASODN可通过下调STAT3基因表达抑制细胞的定植和侵袭，从而为治疗宫颈癌提供了实验依据。雷水生［7］等探讨了ASODN对培养的血管瘤内皮细胞中VEGF表达的影响，发现VEGF的ASODN转染可有效抑制血管瘤内皮细胞VEGF mRNA表达，降低VEGF分泌，从而抑制血管瘤内皮细胞的生长。邱梅园［8］等将靶向血小板源性生长因子受体(PDGFR-α)基因的ASODN转染至人视网膜色素上皮细胞(hRPE)，实验证明ASODN通过抑制PDGFR-α基因表达可显著抑制hRPE细胞的增殖，并能诱导其凋亡，因此，PDGFR-α的ASODN有可能成为治疗或预防增殖性玻璃体视网膜病变发生的新靶点。吴小桃［9］等通过实验确定了基于过氧化物酶体增殖活化受体α(PPAR-α)设计的反义寡核苷酸有较好的抗HBV活性，同时也验证确定了PPAR-α可能成为抗HBV药物的新型作用靶点。

福米韦生(Vitravene)是全球第一个通过FDA批准上市的反义核酸药物，该药主治艾滋病患者中十分常见的巨细胞病毒视网膜炎。Vitravene的上市，预示着反义核酸技术在药物领域已经结出果实，是药物发展的一个里程碑，从而促进更多的反义核酸药物上市，如抗艾滋病病毒新药enfuvirtide(Fuzeon)、专治重症肌无力的EN101(Monarsen)、治疗晚期胶质瘤和胰腺癌的AP12009(Trabedersen)等，还有一些反义核酸药物如治疗慢性淋巴细胞白血病的oblimersen sodium(Genasense)、治疗家族性高胆固醇血症的mipomersen sodium(ISIS301012、KYNAMRO)、抗哮喘药物 EPI-2010等处于注册前期或临床试验中。

1.2 核酶和脱氧核酶

核酶是一类具有催化功能的RNA分子，它能通过碱基配对特异性地切割底物，降解mRNA，使其失去生物学功能，是近年来倍受关注的基因治疗方法。与反义RNA相比，核酶不仅具有封闭mRNA的功能，而且具有切割mRNA的功能。目前对于核酶治疗癌症的研究较多。Zhiguo Rao［10］等通过脂质体法将抗HPV16-E6核酶、空载体质粒分别导入宫颈癌CaSki细胞，对照发现转染核酶的CaSki细胞E6基因的表达明显减少，对化疗药物顺铂敏感性增加了2128倍，细胞凋亡率明显增加，结果证实抗HPV16-E6核酶增加了宫颈癌CaSki细胞对化疗药物顺铂的敏感性，从而为宫颈癌的治疗奠定了基础。Yingying Lu［11］等设计并合成了针对端粒酶RNA的HDV核酶基因，构建了该核酶的真核表达质粒并将其导入肝癌7402细胞、结肠癌HCT116细胞和正常人L02肝细胞中，用于检测该核酶对人端粒酶RNA的体内外切割效力。结果表明，HDV核酶在体外能有效切割端粒酶 RNA，最大切割效率为70.4%;在细胞内能明显抑制端粒酶活性，抑制细胞生长，促进细胞凋亡，该核酶有望成为有效的端粒酶抑制剂，在抑制肿瘤生长中发挥作用。

脱氧核酶是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。脱氧核酶具有切割RNA、切割DNA、激酶、连接酶等活性，其中以对RNA切割活性的脱氧核酶更引人注意，它不仅能催化RNA特定部位的切割反应，而且能从mRNA水平对基因进行灭活，从而调控蛋白的表达。方平［12］等针对突变性 p53(mp53)设计了脱氧核酶"10-23"DZ(p53DZ7、p53DZ9、p53DZ11及硫代修饰物p53DZ11-s)，经脂质体转染进HT29结肠癌细胞株，研究发现p53DZ11、p53DZ11-s在细胞外均能有效切割mp53RNA，在HT29细胞内p53DZ11-s也能抑制mp53-mRNA及mp53蛋白的表达，为p53突变类型的肿瘤基因治疗提供了一个选择。沈雁冰［13］根据HBV-X基因的序列设计针对起始密码的脱氧核酶来阻断HBV-X基因的表达，发现该脱氧核酶对HBV-X基因在肝癌细胞中的表达有一定抑制作用，从而降低肝细胞癌的死亡率，提高慢性HBV感染者的生存质量，具有很大的社会效益及经济效益。王炜琴［14］等利用小发卡状RNA单独及联合脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞中EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)基因的表达，发现小发卡状RNA联合脱氧核酶能够提高抑制EBVLMP1基因表达的效率，该研究将RNA干扰和脱氧核酶技术联合应用，为探讨联合基因治疗在鼻咽癌治疗中的可行性提供了实验基础。

1.3 RNA干扰剂

RNA干扰(RNAi)是指双链RNA导入细胞后诱导靶mRNA发生特异性的降解，导致基因沉默的现象，在细胞中，双链RNA被核酸酶切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA，即小干扰 RNA(siRNA)。siRNA具有高特异性、高效性、稳定性及安全性等特点，目前主要用于肿瘤、病毒性疾病、血液病及神经退行性疾病等的治疗研究［15-18］。夏武［19］等针对 STAT3基因mRNA设计了5条短发卡DNA，构建了重组SiRNA-ST3 质粒(命名为 SiRNA-ST3-1，2，3，4，N)，并将其转染入大细胞肺癌NCI-H460细胞，研究发现构建的重组质粒SiRNA-ST3-2、SiRNA-ST3-3能有效靶向沉默STAT3基因，并抑制NCI-H460细胞的增殖，该实验为大细胞肺癌的临床治疗及基因治疗药物的开发提供了试验和理论依据。Usman［20］等构建了针对HCV NS2-NS5B的 siRNA(NS2si-241，NS3si-229，NS3si-858，NS4Bsi-166，NS5Bsi-241 and NS5Bsi-1064)，并将其转染Huh-7人肝癌细胞，发现这些siRNA都能有效抑制HCV的复制，其中NS5Bsi-1064对HCV RNA的降低超过了90%，这为治疗HCV感染提供了一个更好的选择。刘晓曼［21］等成功构建了靶向HBV S基因的siRNA小环表达载体pmc-H1-siHBS-U6，其能显著抑制HBV基因的表达与复制，该研究不仅对探索HBV的基因治疗提供了可行途径，而且为RNA干扰的应用提供了新的运载体系。对于血液系统常见的恶性肿瘤——白血病，近年来的研究表明大部分是相关基因的研究，因此，RNAi也广泛应用于白血病的相关基因功能研究上，HOXA9基因与白血病发生有关，朱立平［22］等人设计了针对白血病 HOXA9的特异性siRNA，应用阳离子脂质体介导瞬时转染人白血病细胞株U937，结果显示靶向HOXA9的siRNA可有效沉默U937细胞HOXA9基因表达，明显抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，为临床白血病HOXA9基因靶向治疗提供了实验依据。目前已知一些家族性脊髓侧索硬化症(ALS)患者的发病主要是由编码超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因发生显性突变所引起。Wang H［23］等通过化学修饰保护siRNA，并将其注射入转基因小鼠G93A，结果显示经修饰的siRNA不但使突变的SOD1基因得到显著沉默，而且能够广泛分布于中枢神经系统的各个区域并持久稳定存在于神经元和神经胶质细胞中，从而延长了siRNA在小鼠体内的代谢，可为以siRNA作为药物靶向治疗ALS以及其他神经退行性疾病提供更加有效可靠的途径。

2 核酸适配体药物

核酸适配体是利用指数富集配体系统进化技术SELEX筛选出的寡聚核苷酸序列，其作用原理和抗体类似，通过核酸自身形成的三维空间结构和不同靶标，如有机小分子、RNA、DNA或蛋白质等特异性地识别和结合。核酸适配体相比抗体具有免疫原性低、靶分子广、易于体外合成和修饰、价格低廉等优点，已在临床疾病的诊断和治疗中显示了广阔的应用前景。目前，最成功地用于临床治疗的核酸适配体药物是Pegaptanib sodium注射液，商品名为Macugen。Macugen是一种针对血管内皮生长因子(VEGF)的核酸适配体药物，能选择性地抑制VEGF165，而VEGF165水平升高与病理性视神经血管形成和血管通透性增加有关。临床试验证明其除了治疗年龄相关的黄斑退化病，对糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病和视网膜静脉狭窄也有一定的疗效［24，25］，是美国 FDA 在 2004年通过的第一个核酸适配体药物，它的上市将核酸适配体药物的研发推向一个新的高度。

核酸适配体可以独立应用于疾病治疗，也可以和其他药物一起联合使用，在肿瘤、病毒及细菌等方面也发挥着重要作用［26-30］。最早进入临床研究的核酸适配体抗肿瘤药物是AS1411，其靶蛋白为核仁素，该核酸适配体药物在体外具有抑制肿瘤细胞增殖的能力［31，32］。此外，胡艳［33］利用 SELEX 筛选出了一种全新的MUC1核酸适配体MA3，并将阿霉素嵌入MA3的DNA结构构建了适配体和阿霉素(Apt-Dox)的复合体，该Apt-Dox复合体在体外试验中能够选择性地将阿霉素带入MUC1阳性肿瘤细胞，同时降低阿霉素在MUC1阴性肿瘤细胞中的摄取。由于MUC1蛋白在大多数腺癌(乳腺癌、肺腺癌、结肠腺癌等)细胞表面有较高表达，因此该核酸适配体MA3有可能在多种恶性肿瘤的靶向诊疗方面具有潜在的应用价值。Chen［34］等用连有抗肝癌细胞核酸适配体的荧光共振能量转移(FRET)纳米粒实现了对不同肿瘤细胞的检测。张书芹［35］等采用SELEX技术成功筛选到急性髓系白血病(AML)M2型患者CD33+/CD34+细胞的核酸适配体，这为进一步寻找AML-M2白血病细胞表面特异性分子标记物以及AML-M2型白血病的分子诊断创造了基础。张宁［36］等以重组HIV-P24为筛选靶，用SELEX技术从随机寡核苷酸库中成功筛选到特异结合HIVP24的核酸适配体，为其应用于艾滋病诊断和治疗提供了实验基础。Kikuchi［37］等筛选出针对HCV的IRES区域Ⅱ的核酸适配体，IRES对于mRNA的转录很重要，因此该适配体通过影响HCV mRNA的转录，从而影响HCV的复制。蔡江丽［38］等获得结核分枝杆菌分泌蛋白64抗体的核酸适配体并进行血清学检测方面的研究，从而为结核病的诊断提供了实验依据。

3 核酸疫苗

核酸疫苗又称为基因疫苗、DNA疫苗。它是将外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生抗原激活机体的免疫反应，诱导免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗具有制备方便、生产周期短、安全性好、可引起体液免疫和细胞免疫双重效果等优点，被认为是继传统疫苗、基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。近年来，DNA疫苗在基础研究和临床试验中取得了可喜的成果，显示出广阔的应用前景［39，40］。尉秀霞［41］等构建了 EBV 潜伏膜抗原1(LMP1)的重组DNA疫苗pcDNA-LMP1，其能够有效表达LMP1蛋白，并能够在小鼠体内诱导出LMP1特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应;与重组腺病毒疫苗联合应用，可以提高特异性CTL应答水平。梁艳［42］等对结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白Ag85A的DNA疫苗抗结核作用进行了研究，发现Ag85A质粒DNA疫苗可诱导小鼠体液免疫和Th1型细胞免疫应答。Chou B［43］等构建了泛素(ubiquitin)基因与水通道蛋白1(AQP-1)基因融合的DNA疫苗pUB-AQP-1，其在C57BL/6J小鼠中能够有效表达泛素标记的水通道蛋白1，这种泛素标记的水通道蛋白1能够被蛋白酶体降解，从而降低水通道蛋白对肿瘤生长和血管新生的促进作用，发挥抗肿瘤的作用。Weng Y［44］等构建了多发性骨髓瘤黏蛋白1两串联重复区(MUC1-2VNTR)基因的重组DNA疫苗pcDNA3.1-2VNTR，该疫苗能诱导多发性骨髓瘤小鼠肿瘤特异性体液及细胞免疫应答，抑制肿瘤生长，延长小鼠寿命，对多发性骨髓瘤的疫苗治疗有重要意义。

4 展望

近年来核酸药物在人类重大疾病的治疗中展现出巨大的潜力，为现代生物医药产业开辟了一个全新的充满希望的方向。尽管核酸药物仍存在在体内容易被分解和进入细胞难两大瓶颈问题，但相信随着基础生命学研究的进一步深入，当前核酸药物研发面临的问题都将在实践中逐步得到解决，从而为治疗诸多顽症带来新的希望。

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