李瑞文，成姝婷，王正荣

(1.四川大学华西基础医学与法医学院，成都610041;2.成都市妇女儿童中心医院生殖与内分泌实验室，成都610091)

生物节律是指生物为了适应环境，在整个生命过程中，从分子、细胞到机体、群体各个层次上都有明显的时间周期现象，按照周期的长短分为:“短日节律(ultradian rhythm)，长日节律(infradian rhythm)，近周节律(circaseptan rhythm)，近月节律(circamensual rhythm)和近年节律(circannual rhythm)等”。其中近日节律是生物节律中最重要的一种，从单细胞生物到人，几乎存在于所有生物体内部。近日节律主要受生物钟基因的调控，因此，运用现代时间生物学理论及其研究方法来研究生殖疾病是当前的前言热点问题。

1 近日节律与生物钟基因

近日节律又叫昼夜节律，是一种以近似24 h为周期的自主维持的振荡器，在自由运转的情况下，这种节律仍然存在。这种近日节律系统主要包括输入机制、内在的生物钟和输出机制3种。昼夜节律与基因的节奏性表达有关，这些基因常受生物钟调节，基因表达量伴随昼夜循环发生规律性变化。我们把对维持生物体节律起关键性作用的昼夜节律基因称为生物钟基因(clock genes)，其蛋白表达产物称为钟蛋白;处于钟基因下游，受昼夜节律输出信号调控的一系列基因称为钟控基因(clock controlled genes，CCGS)［1］。目前哺乳动物中已发现至少10种以上的生物钟基因，下面介绍几种主要的生物钟基因，及其对近日节律的调节。

Clock基因是King等1997年通过定位克隆策略发现的，是哺乳动物中最早被鉴定的生物钟基因。该研究小组发现单个碱基的突变可以导致生物节律的消失，他们把这种突变称之为Circadian Locomotor Output Cycles Kaput，即昼夜节律运输出周期故障，首字母缩写为 CLOCK，故命名为时钟(Clock)基因［2］。Clock基因在节日节律中起核心作用，小鼠Clock基因的表达为组成型，其产物 CLOCK蛋白是一种转录因子，属于bHLH/PAS(碱性螺旋一环一螺旋/PAS)家族。研究发现，CLOCK蛋白主要是与具有BHLH/PAS转录因子家族成员的脑和肌肉组织芳香羟受体核转运蛋白的类似蛋白-1(Brain and Muscle Amt Like protein，BMAL1)形成异二聚体，再进而连接到下游靶基因启动子的E.box元件上，调控后者表达。Vitaterna和Shearman等在研究发现，Clock突变型小鼠的行为节律出现异常，其纯合子小鼠在持续黑暗中逐渐出现近日节律异常［3，4］。周期基因 period 最早在果蝇中被发现，Konopka和Benzer［5］1971年在果蝇中发现单个基因突变能影响果蝇的昼夜节律，并把该基因定义为period，该基因的发现开创了钟基因时代。在1997年的哺乳动物中也克隆得到了该基因(小鼠为mPer，人为hPer)，小鼠研究表明，该基因存在Per1，Per2和Per3三种亚型。研究表明mPer1，mPer2和mPer3这三种亚型在表达上具有组织和时间特异性，推测这几个基因在哺乳动物日节律中的功能也不同。mPer1、mPer2突变或缺失的大鼠，可以引起昼夜节律的变化，比如mPerl突变小鼠，虽然体外mPer2，mCryl和Bmal1基因的表达水平没有改变，但小鼠的活动周期变短了;mPer2突变则可使mPerl和mCryl表达下降，以及Bmal1表达峰的偏移，进而导致小鼠昼夜活动能力逐渐消失，且mPer1和mPer2双突变的小鼠，在连续黑暗条件下行为节律立即消失;但Per3缺陷的小鼠并不影响其他生物节律基因的表达，近日节律依然存在，mPer3基因对昼夜节律也许是非必需的。

Bmal1又叫MOP3，烃受体核转位蛋白ARNTL(Aryl hydrocarbon receptor nucleartranslocator-like)，JAP3，TIC和ARNTL3等，是哺乳动物生物钟转录、翻译反馈环中的核心成分，以异源二聚体的形式在反馈环中发挥重要的正调节作用。该基因是Ikeda和Nomura在1997年人的基因组中已得到体外表达的小段序列中，发现了一种新的含 PAS结构域(Per，ARNK，ARH，sim domain)的基因序列并成功克隆，该序列被命为Bmal1。Bmall基因的蛋白质产物是转录因子BMAL1，具有碱性螺旋一环一螺旋(bHLH)一PAS结构域。同时有报道指出，BMAL1其不仅仅作为CLOCK的二聚体发挥作用，当mBmal1基因缺失时，小鼠活动节律立即紊乱［6］，说明了其本身也可在生物节律中单独发挥作用。而且，BMAL1还可以与NPAS2(Neuronal PAS domain protein 2)形成异源二聚体来激活某些生物钟基因的表达在端脑部位发挥作用［7，8］。

隐花色素基因(Cryptochrom，Cry)是一个光受体，该基因是在研究哺乳动物DNA修复光解酶过程中发现的，属于植物蓝光受体基因家族和光解酶家族成员，是反馈环唯一的负调节因子，在生物节律中具有重要的作用。最初认为只有高等真核细胞中才有CRY，原核细胞中只有光解酶而没有CRY，但是进一步研究显示，蓝细菌(Synechocystis)中也有CRY，这种新型的CRY被称CRY-DASH［9］。因此CRY在进化上被分为植物CRY、动物CRY和CRY-DASH蛋白三类。目前，在昆虫、鱼类、两栖类和哺乳类中都发现CRY的存在［10，11］。研究表明，不同物种其 Cry基因的亚型不同，昆虫Cry基因包括Cry1和Cry2，果蝇只有Cry1，蜜蜂等膜翅昆虫只有Cry2。小鼠有两个Cry基因(mCryl，mCry2)，但在SCN中，只有mCryl基因RNA呈现节律性表达［12］。mCry2突变将引起自由运动周期延长1 h，而mCryl突变体则表现出相反的表型，如果是两种亚型均发生突变，则生物钟基因Per的节律性丧失，生物节律完全紊乱［13］。

2 生物钟基因在哺乳动物生殖中的作用

生物钟基因的中枢系统在非哺乳类脊椎动物位于松果体(pineal gland，PG)，在哺乳动物位于下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nuclei，SCN)。随着研究的不断深入，学者们发现，这些生物钟基因不仅仅在中枢系统表达，在其他外周组织也存在表达［14-16］，暗示着生物钟基因不仅仅在生物节律中发挥作用，在机体其他代谢中也发挥着重要作用。研究表明，Clock基因存在着基因多态性，这种多态性与睡眠障碍，乳腺癌，DSPS，免疫系统和精液遗传变异等多种疾病相关［17，18］。研究指出成年Bmal1突变小鼠还出现强烈的体脂减少，比如40周龄的野生型雄鼠腹部脂肪可达1.5 g，而突变的小鼠腹部脂肪只有70 mg，说明Bmal1控制着细胞中脂肪的沉积，并对脂肪细胞分化具有促进作用［19，20］。Takarada 等指出，Bmal1 在年轻小鼠的软骨组织中表达［21］，Paschos等指出在脂肪细胞中特异的敲除Bmal1基因会引起肥胖［22］。Pappa等指出，Bmal1与妊娠糖尿病发生相关，但Clock，Per1，Per2，Cry1等生物钟基因却不存在改变［23］。Relles等指出生物钟基因Per2，Clock和Bmal1在胰腺癌中的表达与病理相关，而 Cry1基因表达则无相关性［24］。Milagro等指出Clock，Per2和Bmal的甲基化与肥胖和代谢疾病相关［20］。有报道指出Per2与神经胶质瘤，乳腺癌，结肠癌，，胰腺癌 有关［25，26］。但关于上述基因在人类胎儿流产中是否存在作用，尚未见报道。

近几年研究表明，生物钟基因在哺乳动物的卵巢，输卵管和子宫等生殖器官中均存在表达，指出生物钟基因与哺乳动物生殖相关。Johnson等指出，生物钟基因在早期怀孕小鼠的生殖系统和孕体中存在表达［27］，Kennaway等指出生物钟及钟控基因 Per1，Per2和Bmal1在大鼠的输卵管中呈节律性的表达［28］，Shimizu等指出生物钟基因Bmal1，Cry和Per2在牛的卵巢发育中不受卵泡刺激素的影响，但Clock与卵泡发育相关［16］。Ratajczak等指出，生物钟基因 Bmal1，Clock，Cry1/2和Per1/2在小鼠晚期怀孕的子宫，胎盘和胎膜等组织中均存在表达，提示我们这些生物钟基因与怀孕分娩相关［29］。关于其在精子方面的研究，Alvarez等［30］指出，近日节律基因 Clock、Per1、Per2、Bmal1 和Cry1限制性表达在睾丸精子生成过程中不同的细胞类型。对Clock突变的小鼠Per1表达水平并未降低，这更进一步说明了在睾丸Clock、Bmal1可能表达在精子生成过程中不同的细胞类型，Clock、Bmal1并未形成异二聚体聚合在细胞核内参与驱动转录的过程，且Clock在精子生精过程中圆形精子的顶体具有明显的表达。Morse等［31］指出在生物钟基因Per1或Bmal1在小鼠睾丸未检测到表达，Per1 mRNA在精子发育的精原细胞和精母细胞阶段存在表达。Bittman等［32］也指出，Per1在曲细精管表达，但Per2 mRNA却没有在任何结构中发现。其它研究也表明，精子发育不需要近日节律振荡器。尽管分子钟对精子发育、精子活力和受精能力无作用，但对睾丸雄激素的合成起重要作用。研究指出ClockΔ19突变的雄性小鼠睾丸质量正常、精子计数、精子活力等没有明显改变，但突变小鼠引起雌鼠的胎仔数减少［33，34］，ClockΔ19突变的雌鼠出现排卵程序紊乱，从而造成排卵功能障碍，并且流产、胎儿和胚胎的再吸收情况比例增高，仔鼠的存活率降低［35］。同时有研究表明，Bmal1基因也对哺乳动物生殖有重要影响，如Kennaway等［36］指出Bmal1敲除的雄性小鼠，其精子异常发生率增高，并且很难与正常雌性小鼠卵母细胞成功受精(约占7%);Alvarez等［37］指出敲除 Bmal1基因纯合子(Bmal1-/-)小鼠，尽管显示正常的精子活力和受精能力，但精子数量显著减少。除了在小鼠上的报道之外，有学者指出Per基因在昆虫精子能量释放中存在重要的调控作用［38］。本实验室在研究中发现，干扰Clock生物钟基因后，小鼠死胎和异常发育的胎鼠增多，推测Clock基因与胎儿流产相关，但包括Clock在内的生物钟基因是否与人类胎儿流产相关，其在人类胎儿发育过程中的表达规律如何，这些目前尚未见报道，需要进行大量深入的研究工作来进行证明。

3 结语

总之，生物钟基因在哺乳动物生殖中具有重要的调控作用，但是目前为止，尚有很多问题没有研究清楚，在睾丸，卵巢和流产中的作用机制都没有阐明，需要进一步进行研究，而且采集人的样品有很多限制因素，也限制了研究的进展。我们相信，随着对Clock，Bmal1，Per，Cry等生物钟基因的深入研究，随着现代分子生物学和遗传学的发展，关于这些生物钟基因在哺乳动物生殖中的作用将会更加明确。探索生物钟基因的表达与人胎儿流产的关系，及可能作用的机制，可以为胎儿流产等生殖疾病的研究提供理论依据，为解决人类生殖方面的研究提供新的思路和手段。

［1］李 然，彭小忠，曹济民.哺乳动物日节律基因表达调控研究进展［J］.基础医学与临床，2005，25(7):587-593.

［2］King D P，Zhao Y，Sangoram A M，et al.Positional cloning of the mouse circadian clock gene［J］.Cell，1997，89(4):641-653.

［3］Vitaterna M H，King D P，Chang A M，et al.Mutagenesis and mapping of a mouse gene，clock，essential for circadian behavior［J］.Science，1994，264(5159):719-725.

［4］Shearman L P，Sriram S，Weaver D R，et al.Interacting molecular loops in the mammalian circadian clock ［J］.Science，2000，288(5468):1013-1019.

［5］Konopka R J ，Benzer S.Clock mutants of Drosophila melanogaster［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1971，68(9):2112-2116.

［6］Bunger M K，Wilsbacher L D，Moran S M，et al.Mop3 is an essential component of the master circadian pacemaker in mammals［J］.Cell，2000，103(7):1009-1017.

［7］Reick M，Garcia J A，Dudley C，et al.NPAS2:an analog of clock operative in the mammalian forebrain［J］.Science，2001，293(5529):506-509.

［8］Mongrain V，La Spada F，Curie T，et al.Sleep loss reduces the DNA-binding of BMAL1，clock，and NPAS2 to specific clock genes in the mouse cerebral cortex［J］.PLoS One，2011，6(10):e26622.

［9］Brudler R，Hitomi K，Daiyasu H ，et al.Identification of a new cryptochrome class，structure，function，and evolution ［J］.Mol Cell，2003，11(1):59-67.

［10］Li Y Y，Mao K，Zhao C，et al.Molecular cloning and functional analysis of a blue light receptor gene MdCRY2 from apple(Malus domestica)［J］.Plant Cell Rep，2013，［Epub ahead of print］

［11］Del Pozo A，Vera L M，Sánchez J A，et al.Molecular cloning，tissue distribution and daily expression of cry1 and cry2 clock genes in European seabass(Dicentrarchus labrax)［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2012，163(3-4):364-71.

［12］Kume K，Zylka M J，Sriram S，et al.mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop［J］.Cell，1999，98(2):193-205.

［13］Vitaterna M H，Selby C P，Todo T，et al.Differential regulation of mammalian period genes and circadian rhythmicity by cryptochromes，1 and 2［J］.Proc Nat1 Acad Sci USA，1999，96:12114-12119.

［14］Watanabe M，Hida A，Kitamura S，et al.Rhythmic expression of circadian clock genes in human leukocytes and beard hair follicle cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，425(4):902-907.

［15］Mazzoccoli G，Francavilla M，Giuliani F，et al.Clock gene expression in mouse kidney and testis:analysis of periodical and dynamical patterns［J］.J Biol Regul Homeost Agents，2012，26(2):303-311.

［16］Shimizu T，Hirai Y ，Murayama C，et al.Expressions of the circadian genes Per2，Bmal1，clock and Cry1 during the different stages of follicular development and their regulation by FSH in bovine granulosa cells from small follicles［J］.Livest Sci，2012 ，145(1):292-297.

［17］Zhang J，Ding X，Li Y，et al.Association of clock gene variants with semen quality in idiopathic infertile Han-Chinese males［J］.Reprod Biomed Online，2012 ，25(5):536-542.

［18］Spengler M L，Kuropatwinski K K，Comas M，et al.Core circadian protein clock is a positive regulator of NF-κB-mediated transcription［J］.Proc Natl Acad Sci，2012，109(37):E2457-2465.

［19］Paschos G K，Ibrahim S，Song W L，et al.Obesity in mice with adipocyte-specific deletion of clock component Arntl［J］.Nat Med，2012，8(12):1768-1777.

［20］Milagro F I，Gómez-Abellán P，Campión J，et al.CLOCK，PER2 and BMAL1 DNA methylation:association with obesity and metabolic syndrome characteristics and monounsaturated fat intake［J］.Chronobiol Int，2012，9(9):1180-1194.

［21］Takarada T，Kodama A，Hotta S，et al.Clock genes influence gene expression in growth plate and endochondral ossification in mice［J］.J Biol Chem，2012，287(43):36081-36095.

［22］Paschos G K，Ibrahim S，Song W L，et al.Obesity in mice with adipocyte-specific deletion of clock component Arntl［J］.Nat Med，2012，18(12):1768-1777.

［23］Pappa K I，Gazouli M，Anastasiou E，et al.Circadian clock gene expression is impaired in gestational diabetes mellitus［J］.Gynecol Endocrinol，2013，［Epub ahead of print］

［24］Relles D，Sendecki J，Chipitsyna G，et al.Circadian gene expression and clinicopathologic correlates in pancreatic cancer［J］.J Gastrointest Surg，2013，17(3):443-450.

［25］Chen S T，Choo K B，Hou M F，et al.Deregulated expression of the PER1，PER2 and PER3 genes in breast cancers［J］.Carcinogenesis，2005，26(7):1241-1246.

［26］Xia H C，Niu Z F，Ma H，et al.Deregulated expression of the Per1 and Per2 in human gliomas［J］.Can J Neurol Sci，2010，37(3):365-370.

［27］Johnson M H，Lin A，Fernando D，et al.Circadian clock work genes are expressed in the reproductive tract and conceptus of the early pregnant mouse［J］.Reprod Biomed Online，2002，4(2):140-145.

［28］Kennaway D，Varcoe J，Mau V.Rhythmic expression of clock and clock-controlled genes in the rat oviduct［J］.Mol Hum Reprod，2003，9(9):503-507.

［29］Ratajczak C K，Herzog E D，Muglia L J.Clock gene expression in gravid uterus and extra-embryonic tissues during late gestation in the mouse［J］.Reprod Fertil Dev，2010，22(5):743-750.

［30］Alvarez J，Chen D，Storer E，et al.Non-cyclic and developmental stage-specific expression of circadian clock proteins during murine spermatogenesis［J］.Biol Reprod，2003，69(1):81-91.

［31］Morse D，Cermakian N，Brancorsini S，et al.No circadian rhythms in testis:period1expression is clock independent and developmentally regulated in the mouse［J］.Mol Endocrinol，2003，17(1):141.

［32］Bittman E L，Doherty L，Huang L，et al.Period gene expression in mouse endocrine tissues［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2003，285(3):561-569.

［33］Beaver L M，Gvakharia B O，Vollintine T S，et al.Loss of circadian clock function decreases reproductive fitness in males of Drosophila melanogaster［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(4):2134-2139.

［34］Dolatshad H，Campbell E A，O'Hara L，et al.Developmental and reproductive performance in circadian mutant mice［J］.Hum Reprod，2006，21(1):68-79.

［35］Miller B H，Olson S L，Turek F W，et al.Circadian clock mutation disrupts estrous cyclicity and maintenance of pregnancy［J］.Current Biology，2004，14(15):1367-1373.

［36］Kennaway D.The role of circadian rhythmicity in reproduction［J］.Human Reproduction Update，2004，11(1):91-101.

［37］Alvarez J D，Hansen A，Ord T，et al.The circadian clock protein BMAL1 is necessary for fertility and proper testosterone production in mice［J］.J Biol Rhythms，2008，23(1):26-36.

［38］Kotwica J，Bebas P，Gvakharia B O，et al.RNA interference of the period gene affects the rhythm of sperm release in moths［J］.J Biol Rhythms，2009，24(1):25-34.