王继贵

(中南大学湘雅二医院，湖南长沙410011)

蛋白质的氨甲酰化作为慢性肾衰时的生物标志物

王继贵

(中南大学湘雅二医院，湖南长沙410011)

许多研究已证实氨基甲酰化的蛋白质涉及各种疾病的进展，特别是慢性肾衰。本文的目的是介绍非酶促蛋白质翻译后修饰的概况以及其在体内的影响，并评价其作为生物标志物的临床用途。

氨甲酰化；生物标志物；慢性肾衰

氨甲酰化是蛋白质翻译后的一种修饰，来自于异氰酸(isocyanic acid)共价结合到蛋白质上，涉及在蛋白质分子成熟(ageing)过程中非酶促反应之一(即糖化、氧化或氨甲酰化)。这些翻译后修饰的特征是在蛋白质上形成共价结合的加合物，该加合物被称作翻译后修饰衍生的产物(posttranslationalmodification-derived products,PTMDPs),它可使蛋白质的结构和功能特性发生改变[1]。

因为由氨甲酰化来的产物(carbamylation-derived products,CDPs)是有生物活性的化合物，它能触发特殊的及不适当的细胞反应，例如氨甲酰化可促进激素和酶失活、蛋白质功能发生改变。CDPs在体内的积聚，能诱导疾病的发生和进展。监测CDPs对特定疾病是一种可能的生化标志物[2]，对慢性疾病复杂性的诊断和治疗给予新的洞察力。本文拟对氨甲酰化研究的进展作一简要介绍。

1 氨甲酰化反应的生物化学

氨甲酰化指的是加在蛋白质或氨基酸的功能基上的“氨基甲酰”部份(-CONH2)，这个反应主要来自于异氰酸和蛋白质之间的相互作用。在体外，异氰酸盐同氨基、硫醇和苯酚基或羧基相互作用，硫醇和苯酚基显示有最高的反应性，但是，它是可逆的，因此，限制了它对蛋白质特性的影响。相反，氨基酸或蛋白质的氨基不可逆地结合到异氰酸上，而且α-氨基比赖氨酸侧链ε-氨基反应快约100倍，因为它们的pKa较低。

在人类，异氰酸主要由血液中的尿素自发地分解形成氰酸盐(-N＝C＝O)和含氨物质，它在水溶液中发生，根据平衡反应，它促成99%以上的尿素分解，形成的氰酸盐迅速转变成它的反应型异氰酸(HN=C=O)[3]。因此，在慢性肾衰时(Chronic renal failure,CRF)其特征是长期高尿素血症，它促进异氰酸的形成。在健康个体中，血浆异氰酸的浓度大约为50nmol/L，而在CRF的病人中它达到150nmol/ L。在体内，异氰酸和蛋白质、氨基酸和其他分子之间相互作用，使得这些分子中的氨甲酰化，导致它们的结构、电荷和功能发生改变。影响细胞外和细胞内的各种功能，出现慢性组织损害，是导致疾病发病机理的重要因素。有研究发现在CRF的肾组织中有氨甲酰化的蛋白质，但是在正常移植肾中则没有[3]。

然而，尿素分解不是导致异氰酸形成的唯一途径，特别是在非CRF的病人中。氰酸盐也可来自硫氰酸盐的代谢，在抽烟的人中，血中硫氰酸盐浓度升高。在过氧化氢存在时，髓过氧化物酶催化H2O2氧化硫氰酸盐(-N=C=S)生成氰酸盐(-N=C=O)和次硫氰酸(HO-N=C=S)，氰酸盐迅速地转变成异氰酸，后者在炎症中促进蛋白质的氨甲酰化[4]。

理论上讲，体内所有蛋白质都可以氨甲酰化。然而，每种蛋白质氨甲酰化的可能性，取决于多种参数，如数量和氨基的可接近性，以及蛋白质的寿命。不同的氨基参与反应，则形成不同的氨甲酰化产物，当α-氨基参与反应时，则形成α-甲氨酰氨基酸(或α-甲氨酰蛋白质)；当蛋白质的赖氨酸ε-氨基参与反应时，则形成ε-甲氨酰赖氨酸(也叫高瓜氨酸，homocitrulline)。血浆结合的高瓜氨酸水平，可独立地预测冠心病、将来发生心肌梗死、脑卒中和死亡的危险因素增加[4]。

2 病理生理学中涉及蛋白质氨甲酰化的基本原理

在人类，首次证实蛋白质氨甲酰化的有害效应是在70年代初得出的。当时用尿素治疗镰状细胞贫血病人，因为它能阻滞、甚至逆转镰状形成。已提示有两个机制解释它的有益作用：(1)尿素分子本身直接干扰镰状化形成；(2)由尿素衍生的异氰酸致HbS的氨甲酰化，它增加氧的亲和性以及降低聚集特性。后来用氰酸钠(Sodium cyanate)作为一种口服治疗剂，然而，已观察到意外的副作用，某些病人在口服氰酸钠的过程中发生了白内障。这个现象可以用α-晶体蛋白氨甲酰化来解释，它诱导构象改变，使晶体蛋白浑浊。长寿蛋白质特别倾向于翻译后修饰，氨甲酰化促进晶状体老化和白内障[5]。

氨甲酰化改变蛋白质的结构特性，突出的影响是除去了正电荷，它使蛋白质与水的相互作用改变，且扰乱了离子对蛋白质表面的相互作用，因为这些相互作用被认为可稳定蛋白质的二级和三级结构，它们的丧失导致显著地构象改变。氨甲酰化也干扰蛋白质-蛋白质间的相互作用。例如，I型胶原蛋白的氨甲酰化诱导它的三级螺旋结构构象改变，降低聚合成正常胶原纤维的能力，这些改变同氨甲酰化胶原无力刺激中性分叶核粒细胞的氧化功能有关[6]。胶原的氨甲酰化可以改变体内胶原和炎性细胞之间的相互作用和干扰细胞外基质正常结构的改变。

Ha等[7]研究了氨甲酰化白蛋白(cAlb)对微小RNA(miRNAs)表达的影响，发现miR-146a/b的表达受cAlb显著地诱导，miR-146a增加12.75倍，miR146b增加5.88倍。由于cAlb刺激，miR-146 a/ b水平增加，P＜0.05。也发现在肾细胞癌肿瘤组织中，miR-146a/b表达水平增加，与相应的非肿瘤组织比较，P＜0.05。对于cAlb的功能进一步研究，可以提供对肾细胞癌病理生理学新的洞察力。

3 疾病时蛋白质的氨甲酰化

在体内，因为异氰酸形成的途径，氨甲酰化优先涉及在2个病理生理过程：CRF和动脉粥样硬化[8,9]。在CRF时，慢性尿毒症刺激LDL氨甲酰化(cLDL)，cLDL是一种潜在的导致动脉粥样硬化因子。本文主要阐述在CRF时涉及的病理生理过程。

在CRF时，氨甲酰化是尿毒症的一个后果，也是此病的一个恶化因素。例如氨甲酰化的白蛋白是增进肾小管损害的一个原因，及促进小管周围纤维化[10]。而且，氨甲酰化的血浆蛋白质刺激肾小球增殖以及胶原蛋白合成，因此，有助于肾纤维化。纤维化也能来自于无活性的酶，它涉及结构改变的细胞外基质，及来自不稳定的结构改变的胶原蛋白。的确，氨甲酰化诱导胶原蛋白三维螺旋构象的不稳定性，是造成蛋白水解敏感度改变的原因，因为氨甲酰化的胶原蛋白显示对胶原蛋白酶有更大的抵抗性，但是对明胶酶的敏感度增加[11]。而且，氨甲酰化蛋白质可调节炎性细胞的功能，如氨甲酰化白蛋白对中性多形核粒细胞的呼吸爆发(respiratory burst)作用的抵制效应可以说明[12]。呼吸爆发是指在再灌注期间，组织重新获得氧供应，激活中性粒细胞耗氧显著增加，产生大量氧自由基。中性多形核中性粒细胞氧化功能的这种失调可以促进在尿毒症病人中所观察到的炎性及感染性疾病。尿毒症促成游离氨基酸转变成氨甲酰化氨基酸，后者已被证实为尿毒症的毒素，因为它们干扰蛋白质的合成及转氨作用，且促成胰岛素抵抗。

4 可利用的生物标志物及它们与临床的关联

4.1 氨甲酰化的血红蛋白(cHb)cHb主要来自异氰酸共价结合到珠蛋白β-链的N末端缬氨酸残基上，可达总Hb的2%。最初认识cHb是在用离子交换层析法测定HbAlc时的一种分析干扰物。cHb也构成HbAlc形成时的“病理生理干扰”，因为异氰酸同葡萄糖竞争结合N-末端缬氨酸残基，尿毒症病人测得的HbAlc值应小心解释[13]。cHb通常用HPLC紫外检测器检测在酸水解得到的N-甲酰缬氨酸的乙内酰脲衍生物。cHb浓度的表达以每克的总Hb中所含缬氨酸乙内酰脲(Valine hydantoin, VH)的微克数表示(μg VH/gHb)，在健康个体参考范围为27～38μg VH/gHb；在CRF病人中此值约高5倍。cHb增加同Hb暴露于高浓度尿素的时间和程度两者相关，提示cHb在鉴别急性或慢性肾衰病人时是一个有用的生物标志物。Tarif等[14]研究了CRF病人透析期间cHb水平的变化，结果显示CRF病人cHb水平增加，且同血液尿素浓度呈正相关，可以更好地反映透析期间尿素浓度的改变，可以用作尿毒症控制的一个更准确的指征。临床上，良好透析的病人cHb水平应低于100μgVH/ gHb。

4.2 cLDL它是人血清中的一种非酶促修饰的LDL，通过尿素自发分解产生的氰酸盐诱导LDL氨甲酰化而形成的cLDL，在CRF的病人则显著增加，可引起心血管并发症。目前已发展了ELISA法测定血清cLDL浓度[15]。40例健康对照其浓度为86.1±29.7mg/L，41例终末期肾病血清cLDL浓度则显著增加，为281.5±46.9mg/L，P＜0.001。此试验简单，容易操作，在肾病及健康个体中对心血管疾病的研究，是一个潜在的有价值的工具。

4.3 蛋白质结合的高瓜氨酸前已述及当蛋白质的赖氨酸ε-氨基参与反应时，则形成ε-甲氨酰赖氨酸，也称之为高瓜氨酸[4]。Mydel等[16]报告蛋白质的翻译后修饰有可能产生抗原的新表位(neoepitopes)，其后它可能触发免疫反应。赖氨酸残基的氨甲酰化形成高瓜氨酸，可能是触发炎性反应的一个关键机制。在用鼠模型评价触发免疫反应中氨甲酰化的作用，发现含有高瓜氨酸肽的鼠，免疫诱导趋化性、T细胞激活及抗体的产生，鼠也产生侵蚀性关节炎。T细胞反应来自高瓜氨酸肽，以及随后产生的抗高瓜氨酸自身抗体，是诱导自身免疫反应的关键。抗高瓜氨酸肽抗体对关节炎的发病机理提供一个新的机制。

5 小结

上述讨论涉及蛋白质氨甲酰化反应的生物化学及与临床的关联。因为氨甲酰化产物的测定目前尚需高精设备，有些方法尚未标准化，因此多在研究实验室使用。然而，大量的证据表明蛋白质和氨基酸的氨甲酰化涉及在多种疾病的发病机理及进展中，对于洞察疾病的发病机理可以提供新的信息。随着科学技术的不断进步，可利用的分析方法不久就会逐步进入临床应用。

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1674-1129(2013)05-0409-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.001

王继贵，男，1937年生，湘雅二医院检验科原主任，主任检验师，研究方向为临床生物化学。