苏红，周波，段雅倩，杜超

所谓“代谢记忆”现象是指高糖介导的微血管病变即使在后续血糖控制达标后仍可持续进展[1-2]。体内外研究已证实氧化应激、晚期糖基化终末产物(AGEs)形成、蛋白激酶C(PKC)β2的激活等生化异常和表观遗传修饰与代谢记忆的启动和维持关系密切[3]，但大量随机对照试验却表明针对上述单一“经典”的生化机制进行干预后结果并不理想[4]，因此探寻微血管固有细胞中上述机制的汇聚点正成为学界的关注热点。本小组及Kaur等[5]均发现高糖应激可诱导转录共激活子p300激活，且p300可发挥组蛋白乙酰化修饰作用，从而使转录因子介导的效应基因表达在血糖正常后仍持续开放。目前，尚不清楚p300是否为代谢记忆各种刺激共同的信号“记忆”分子。为此，本研究以人系膜细胞(HMCs)作为体外模拟高糖记忆的研究对象，观察p300及组蛋白乙酰化、PKCβ2和活性氧(ROS)的表达规律，并探讨p300和组蛋白乙酰化蛋白H3(Ac-H3)、Ac-H4在其中可能的潜在作用，为整合代谢记忆机制及防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 HMCs由重庆医科大学基础医学研究所惠赠。PKCβ2重组腺病毒载体(Ad5-PKCβ2)、重组腺病毒空载体(Ad5-null)的合成及鉴定已由本课题组完成[6]。DMEM培养基购自Hyclone公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；牛血清白蛋白和CGP53353购自Sigma公司；D-葡萄糖购自加拿大Bio Basic公司；兔抗PKCβ2、兔抗p300及兔抗Ac-Histone H4多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗Ac-Histone H3多克隆抗体购自Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG购自北京博奥森公司；活性氧检测试剂盒和β-actin小鼠单克隆抗体购自江苏碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HMCs用含10%新生牛血清的DMEM培养液培养于37℃，饱和湿度5%CO2的培养箱中。隔日换液，实验前给予无血清DMEM培养液孵育细胞24h使其生长同步化，根据后续实验设计分组培养细胞。

1.2.2 AGEs-BSA的制备 参照Valencia等[7]的方法并进行改良。在1mol/L、pH为7.4的PBS溶液中加入一定量的葡萄糖使其终浓度为500mmol/L，待充分溶解后，加入牛血清白蛋白(BSA)溶液，使其终浓度为50mg/ml。采用0.22μm的针头滤器过滤除菌，避光于37℃孵箱孵育90d。以不含葡萄糖的BSA溶液按上述方法配置作为对照。经孵育的血清用PBS充分透析除去未结合的葡萄糖，过滤除菌，分装封口后冷冻保存备用。取少量样品采用荧光分光光度仪(激发波长380nm，发射波长450nm)进行光谱扫描及浓度测定。结果以任意荧光单位(AFU)表示。

1.2.3 实验分组 根据预实验结果，分别用H2O2(100μmol/L，30min)和AGEs(250μg/ml，48h)干预HMCs，并选择感染复数(multiplicity of infection，MOI)=10进行Ad5-PKCβ2及Ad5-null的转染。

1.2.3.1 高糖诱导代谢记忆模型 模拟高糖诱导代谢记忆，观察高糖诱导HMCs对p300及组蛋白乙酰化表达是否有记忆效应，同时是否伴有氧化应激和PKCβ2的持续激活。实验分为：正糖组(NG，5.5mmol/L D-葡萄糖×2d)；渗透压组(LG，NG+20mmol/L L-葡萄糖×2d)；高糖组(HG，25mmol/L D-葡萄糖×2d)；记忆组(M1、M2、M3，25mmol/L D-葡萄糖×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3、6、9d)；持续正糖组(5.5mmol/L D-葡萄糖×9d)。

1.2.3.2 糖基化终末产物记忆模型 模拟糖基化终末产物记忆，分为正糖组(NG，5.5mmol/L D-葡萄糖×2d)；正糖+AGEs组(AGEs，5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d)；AGEs记忆组(AGEs-M，5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)；BSA组(NG+BSA，给予同浓度BSA对照)。

1.2.3.3 H2O2模拟氧化应激记忆模型 体外用H2O2模拟氧化应激记忆，分为正糖组(NG，5.5mmol/L D-葡萄糖×30min)；正糖+H2O2组(H2O2，5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min)；H2O2记忆组(H2O2-M，5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)；正糖对照组(NG3，5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)。

1.2.3.4 PKCβ2激活记忆模型 体外转染PKCβ2过表达载体模拟PKCβ2激活记忆，分为正糖组(NG，5.5mmol/L D-葡萄糖×2d)；高糖组(HG，25mmol/L D-葡萄糖×2d)；记忆组(M，25mmol/L D-葡萄糖×2d +5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)；空载体记忆组(HN，25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-null×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)；PKCβ2激活记忆组(PO，25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-PKCβ2×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)；PKCβ2抑制剂记忆组(PI，25mmol/L D-葡萄糖×2d+10μmol/L CGP53353+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)。

1.2.4 细胞内ROS检测 不带荧光的二氢二氯荧光素(DCFDA)可自由穿透细胞膜进入细胞，在细胞内可被ROS氧化生成荧光物质DCF，其荧光强度可反映细胞内ROS含量。细胞经上述分组培养于6孔板后，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10μmol/L。吸弃板内培养液，每孔加入1ml 10μmol/L DCFH-DA，37℃避光孵育45min，采用无血清培养液洗涤细胞3次，用倒置荧光显微镜及荧光酶标仪(激发波长485nm，发射波长530nm)检测各组细胞内荧光强度。

1.2.5 Western blotting检测蛋白表达 参照文献[5]方法并加以改良，根据预先分组处理收集细胞，提取总蛋白并定量。分别经6%(p300)、10%(PKCβ2)和15%(Ac-H3、Ac-H4)SDS-PAGE电泳分离后，电转至PVDF膜；分别加入兔抗p300多克隆抗体(1:500)、兔抗PKCβ2多克隆抗体(1:500)、兔抗Ac-H3多克隆抗体(1:3000)、兔抗Ac-H4多克隆抗体(1:500)和β-actin抗体(1:1000)，于4℃过夜；TBST洗膜后再分别加入HRP标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG(1:2500稀释)，37℃孵育1h；采用ECL试剂化学发光显色，用Quantity One分析软件系统测定蛋白条带灰度值。

1.3 统计学处理 各实验独立重复3次。应用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据以x±s表示。采用单因素方差分析(ANOVA)进行多组均数间计量资料的比较，组内两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高糖记忆对HMCs表达ROS水平的影响与NG组相比，LG组和NC组ROS荧光强度无统计学差异。HG组ROS荧光强度较NG组增加了87%(P＜0.05)，而高糖培养后再正糖培养3、6、9d，ROS荧光强度仍较NG组分别增加了79%、63%和48%(P＜0.05，图1)。该结果表明，高糖可增加HMCs ROS表达，当糖浓度恢复正常后ROS仍持续激活，且至少可以存在9d。

2.2 高糖记忆对HMCs p300、Ac-H3、Ac-H4和PKCβ2蛋白水平表达的影响 与NG组相比，HG组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达均显著上调，分别增加了115%、93%和87%(P＜0.05)；而LG组与NG组相比，各蛋白表达差异无统计学意义，说明高糖可上调p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达，该效应与渗透压无关。高糖培养2d后再继续正糖培养3、6、9d，p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白的表达仍较NG组显著升高(P＜0.05)，其中M3组较NG组上述蛋白表达分别增加了75%、49%和47%(P＜0.05)。同样，高糖可诱导HMCs PKCβ2蛋白显著上调，与NG组比较增加了130%，而M1、M2和M3组PKCβ2蛋白表达较NG组表达仍增高，差异有统计学意义(P＜0.05，图2)。以上结果提示，高糖诱导的HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达增高在糖浓度恢复正常后持续存在，且同时伴PKCβ2表达的持续激活。

2.3 AGEs诱导糖基化终产物记忆模型下HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达 基于上述高糖记忆时间，选取AGEs干预后再正糖培养3d模拟糖化终产物记忆。Western blotting检测结果显示，在生理糖浓度(5.5mmol/L)时，BSA并不增加HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白的表达，而AGEs组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达水平均显著升高，较对照组分别升高了1.73倍、1.08倍和1.05倍(P＜0.05)。AGEs-M组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达较对照组分别升高了1.47倍、0.95倍和1.03倍(P＜0.05，图3)。该结果提示，AGEs诱导HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达上调，且当除去AGEs后继续正糖培养3d，p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达差异仍有统计学意义，存在记忆效应。

图1 各组人肾小球系膜细胞ROS水平变化(荧光显微镜 ×200)Fig. 1 Changes of intracellular reactive oxygen levels in each group of HMCs (Fluorescence microscope ×200)A. Normal glucose group; B. Osmotic control group; C. High glucose group; D. High glucose (2d)+normal glucose (3d) group; E. High glucose(2d)+normal glucose (6d) group; F. High glucose (2d)+normal glucose (9d) group; G. Continue normal glucose (9d) group

图2 高糖诱导各组系膜细胞p300、Ac-H3、Ac-H4蛋白和PKCβ2蛋白表达的Western blotting检测Fig. 2 Expression of p300, Ac-H3, Ac-H4 and PKCβ2 protein induced by high glucose in each group of HMCs (Western blotting)NG. Normal glucose group; LG. Osmotic control group; HG.High glucose group; M1. high glucose (2d)+normal glucose (3d)group; M2. High glucose (2d)+normal glucose (6d) group; M3. High glucose (2d)+normal glucose (9d) group; NC. Continue normal glucose (9d) group

图3 AGEs干预系膜细胞各组p300、Ac-H3、Ac-H4蛋白表达水平的Western blotting检测Fig. 3 Expression of p300, Ac-H3 and Ac-H4 protein induced by AGEs in each group of HMCs (Western blotting)NG. Normal glucose group; AGEs. Normal glucose+AGEs group;AGEs-M. Normal glucose+AGEs followed by normal glucose for 3d group; BSA. Normal glucose +BSA group

2.4 H2O2诱导氧化应激记忆模型下HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白的表达 Western blotting显示，H2O2干预系膜细胞后p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达水平均升高，较对照组分别升高了103%、85%和79%(P＜0.05，图4)，而H2O2-M组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义，表明单纯H2O2诱导氧化记忆模型下p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达记忆效应不明显。

2.5 PKCβ2激活记忆模型下HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达 采用增强和抑制双重策略，如图5所示，与M组相比，HN组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达差异无统计学意义；PO组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达较M组进一步上调，伴有PKCβ2蛋白表达增加，分别为M组的1.25倍、1.06倍、1.10倍和1.17倍(P＜0.05)；而PKCβ2抑制剂则可下调上述蛋白表达(P＜0.05)。提示PKCβ2激活介导高糖所致HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4的记忆效应。

图4 H2O2干预系膜细胞各组p300、Ac-H3、Ac-H4蛋白表达水平的Western blotting检测Fig. 4 Expression of Ac-H3, Ac-H4 and p300 proteins in each group of HMCs after exposure to hydrogen peroxide (Western blotting)NG. Normal glucose group; H2O2. Normal glucose+H2O2 group;H2O2-M. Normal glucose+H2O2 followed by normal glucose for 3d group; NG3. Normal glucose control group

图5 PKCβ2激活对系膜细胞各组p300、Ac-H3、Ac-H4蛋白表达水平的影响(Western blotting)Fig. 5 Infl uence of PKCβ2 activation on the expression of Ac-H3,Ac-H4 and p300 protein in each group of HMCs (Western bloは ing)NG. Normal glucose group; HG. High glucose group; M. Memory group; HN. High glucose+empty vector memory group; PO. High glucose+PKCβ2 memory group; PI. High glucose+ PKCβ2 inhibitor CGP53353 memory group

3 讨 论

自2008年EI-Osta等[8]首次发现短暂高糖即可使核因子-κB亚基p65启动子区组蛋白甲基化重塑以来，表观遗传学修饰与代谢记忆的关系开始受到重视。与组蛋白甲基化既可开放亦可关闭基因表达的作用不同，组蛋白乙酰化常因中和电荷和增强疏水性作用，使转录因子更易与DNA结合，引起RNA聚合酶顺利通过核小体阵列，导致转录事件的发生[9]。本研究结果显示，高糖负荷HMCs可显著上调Ac-H3和Ac-H4蛋白表达，国外学者采用染色质共沉淀-测序技术分析了高糖负荷血管细胞表观修饰模式，结果发现组蛋白H3K9、H3K14呈高度乙酰化，并参与了内皮功能异常的发生[10]。他们同时还发现预先高糖培养HMCs 2d再恢复正糖培养3、6、9d，Ac-H3和Ac-H4蛋白水平仍较正糖组显著上调，与Zhong等[11]在细胞和糖尿病大鼠记忆模型中的研究结果相似。以上结果表明高糖可诱导靶细胞染色质组蛋白乙酰化重塑，且该效应在血糖恢复正常后仍持续存在。

研究表明，代谢记忆的分子本质是糖尿病诱导的关键靶细胞中特定转录复合器在血糖正常后持续启动，介导后续核内基因表达谱异常[8]。已证实基因转录不仅受到众多转录因子、转录共激活子的调控，还受到表观遗传调控，而后者可作为一种标记或语言，随细胞分裂而持续传递，其中兼有多功能转录共激活子和组蛋白乙酰化转移酶(HAT)活性的p300在代谢记忆中的变化规律备受关注。本研究结果显示，高糖负荷HMCs可显著上调p300表达伴Ac-H3、Ac-H4蛋白表达增加。Yun等[12]在高糖培养的单核细胞模型中，亦发现p300蛋白表达上调和HAT活性增强。本研究还发现，当高糖培养2d恢复正糖培养后，p300蛋白表达仍较正糖组显著增高，且至少可持续9d。p300包含多个保守结构域[13]，不仅可提供多蛋白复合物装配的支架，发挥转录因子和基本转录复合物的桥梁作用，而且p300具有HAT活性，可催化乙酰辅酶A中的乙酰基转移到组蛋白N-端赖氨酸残基上，通过表观修饰导致核因子-κB(NF-κB)、活化蛋白-1(AP-1)、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)等转录因子活性增加，从而诱导代谢记忆表型形成[8]。

高糖介导的微血管病变“记忆”效应的发生是多物质参与、多因素、多环节的复杂病理生理过程[14]。本研究发现HMCs于高糖作用后ROS水平显著升高，同时伴有PKCβ2的激活，当恢复正糖培养3、6、9d后，ROS水平及PKCβ2蛋白表达较正糖组仍显著上调，此结果与本小组的前期研究[15]及Roy等[16]的研究结果类似。有趣的是，虽然高糖可引起ROS增加伴随p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达上调，但是本研究采用H2O2模拟氧化应激记忆，H2O2干预后去除刺激因素再正糖培养3d，原先上调的p300、Ac-H3及Ac-H4蛋白水平则显著下降，说明单纯的氧化应激并不介导高糖引起的HMCs p300及组蛋白乙酰化记忆效应。国外学者Ceriello等[17]认为ROS是病理生理状态下生化反应的瞬时代谢产物，可被机体正常抗氧化防御系统清除，在控制血糖至正常后不易在机体内长期蓄积，难以解释糖尿病患者持续十几年或更长时间的代谢记忆，与本研究结论一致。但去除高糖后，高糖引起ROS增加伴随p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达上调持续存在的机制尚未明了。我们认为此可能与高糖诱发氧化应激，加重了PKCβ2激活，形成恶性循环有关。本实验通过重组腺病毒Ad5-PKCβ2过表达模拟PKCβ2激活记忆现象，结果显示PKCβ2激活可进一步上调p300及乙酰化组蛋白的表达，且该效应在正糖培养后仍持续存在，而给予PKCβ2选择性抑制剂CGP53353处理则可使上述蛋白的表达水平明显下调。同时本小组既往研究已证实，给予抗氧化剂可下调正糖培养后原本由高糖诱导的PKCβ2持续激活，进一步支持氧化应激-PKCβ2在高糖诱导的p300及组蛋白乙酰化重塑记忆效应中的重要作用[15]。有研究表明，高糖诱导的ROS生成增多，可引起DNA链断裂，导致核内DNA修复酶-聚腺苷二磷酸核糖聚合酶过度激活，适应性地上调p300及组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性，开放抗氧化基因表达以利于DNA修复，但当伴有PKCβ2激活时，通过丝裂素活化蛋白激酶和蛋白激酶B信号途径，从而使短期、适应性的表观修饰转变为长期、持续性的p300激活和组蛋白修饰，即使高糖因素撤出，仍可造成靶细胞的持续损害[18]。此外，本研究还在AGEs模拟的蛋白非酶糖化记忆模型下，证实p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白在AGEs干预组表达较对照组显著升高，继续正糖培养后各蛋白表达仍显著上调，提示AGEs对转录共刺激子p300及组蛋白乙酰化有记忆效应。研究表明，AGEs可通过AGEs受体(RAGE)，使NF-κB激活，介导RAGE mRNA表达增加，形成RAGE-NF-κB正反馈环[19]。目前已在多个细胞系中观察到NF-κB活性受p300及HAT活性的调节，因此我们推测一旦AGEs作用于靶细胞，活化RAGE-p300-NF-κB正反馈环，就可不依赖于AGEs，表现出持续激活p300的记忆特征。总之，本研究结果显示高糖诱导的HMCs p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达上调存在记忆效应，且p300及组蛋白乙酰化可能系高糖致ROS、AGEs、PKCβ2记忆刺激的汇聚点。此不仅将代谢记忆的生化机制和表观遗传统一起来，而且亦为关闭代谢记忆探索了新的方向。

志谢：感谢眼科学重庆市市级重点实验室在本研究中给予的支持！

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