李 言，谢云飞，钱 和，姚卫蓉

(江南大学食品学院，江苏无锡214122)

赤藓红，又名樱桃红、四碘荧光素、食品色素3号，英文名为Erythrosine，是一种常用的人工合成食品添加剂。我国《食品添加剂使用卫生标准》规定［1］，用于调味酱时最大使用量0.05g/kg;用于高糖果汁(味)或果汁(味)或果汁(味)饮料、碳酸饮料、配制酒、糖果、糕点上彩装、青梅最大使用量0.05g/kg;用于红绿丝、染色樱桃(系装饰用)最大用量0.10g/kg。由于过量食用赤藓红对人体健康具有潜在的危害性，联合国粮农组织和世界卫生组织规定，赤藓红的每日允许摄取量为0～1.25mg/kg。食品中赤藓红含量的测定标准方法为纸色谱、薄层色谱法和高效液相色谱法［2］，已见文献报道的方法包括:分光光谱法［3－4］、示波极谱法［5］、毛细管电泳法［6］及胶束敏化化学发光法［7］等。然而，所有这些方法既耗时又昂贵，操作复杂，且不适宜现场监测。如今正急需开发出一种快速简单的方法来检测食品中的赤藓红。近来，由于拥有高灵敏性和检测速度快等优点，表面增强拉曼光谱(SERS)吸引了众多的目光。自从1970年被发现以来［8］，表面增强拉曼光谱已经被广泛应用在分子、病原体、细胞甚至整个活体动物的研究［9］。用于表面增强拉曼光谱的增强基底包括金纳米颗粒［10］、银纳米颗粒［11］、金银纳米粒子［12］、金薄膜［13］、银薄膜［14］和银纳米棒［15］。金胶因其良好的稳定性、易制备和优秀的SERS增强效果，被广泛应用在生物化学和医药方面的表面增强拉曼光谱检测。利用表面增强拉曼光谱法测定赤藓红尚未曾见文献报道。文章研究了赤藓红的拉曼光谱，并通过金胶研究了其SERS光谱，同时用密度泛函理论法对待测物的分子结构进行了计算并优化。文章通过优化系统条件(如调节pH)建立了SERS检测方法。文章对快速检测食品中过量添加的赤藓红的可行性进行了研究，该技术对快速、准确的检测食品中的赤藓红很有价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赤藓红、氯金酸钾 Sigma公司，99%;柠檬酸三钠 上海国药集团，99%;硝酸、盐酸 北京化工厂，98%;所有水溶液 采用milipore超纯水配制。

OptoTrace RamTracer®－200－HS便携式表面增强拉曼光谱仪 激发波长785nm，扫描范围100～3300cm－1，光谱分辨率6cm－1，美国 Silicon Valley公司;Unico UV－4802紫外吸收光谱仪 扫描范围300～800nm，美国Unico NJ公司。

1.2 赤藓红标准溶液

先配制1000μg/mL的赤藓红原液，超声5min。然后从原液依次稀释100、10、1、0.1μg/mL的不同梯度。

1.3 制备金纳米颗粒

本实验采用化学还原法制备金纳米粒子［16］。所有的玻璃仪器在王水［硝酸/盐酸(1∶3体积比)］浸泡清洗后使用。具体合成过程如下:将2mL柠檬酸三钠(1%)溶液快速加入到搅拌条件下煮沸的氯金酸钾溶液(50mL，0.6mg/mL)中，再继续加热30min，可得红棕色悬浮液，然后自然冷却至室温。制备的金纳米粒子的紫外最大吸收峰在556nm。

1.4 拉曼测量

测量范围为 100～3300cm－1，激光功率为300mW，积分时间5s。测量纯赤藓红粉末作为赤藓红固体拉曼光谱。

赤藓红溶液与金胶以不同体积比混合之后，比较不同的混合时间，剧烈摇匀，然后加入不同体积比的硝酸溶液以调节待测体系的pH。选取最特征的拉曼增强峰用于讨论赤藓红浓度与信号峰强度之间的关系。将赤藓红浓度逐渐降低，大部分赤藓红特征峰仍然可见时的最低浓度视为赤藓红的检测限。

1.5 理论计算

本研究采用高斯03软件包对赤藓红分子进行构型优化和光谱计算。密度泛函计算时采用了Becke的三个参数混合交换功能(B3)［17］和Lee，Yang and Parr的相关理论(LYP)［18］，最高基组水平为6－31G(d)，计算结果通过Gaussview 5.0(Gaussian，Inc.，PA，USA)查看。

2 结果与讨论

2.1 赤藓红理论计算与实验拉曼光谱比较

密度泛函理论被广泛应用在分子构型优化和振动光谱计算中。图1所示为赤藓红的分子构型，同时比较了理论计算与实验拉曼光谱。可以看出，赤藓红理论计算拉曼光谱与实验拉曼光谱基本一致。

图1 赤藓红拉曼光谱Fig.1 Raman spectra of erythrosine

2.2 赤藓红与金胶不同体积比

待测样品与金胶的体积比是影响测量信号的重要因素，研究了不同体积比的赤藓红与金胶的表面增强拉曼光谱。如图2所示，当赤藓红与金胶的体积比为1∶1时，赤藓红的SERS信号在1234、1326、1550cm－1等处信号都相对最强，因此本实验中均采用这个比例进行研究。

图2 赤藓红与不同比例金胶混合之后的SERS图Fig.2 SERS spectra of erythrosine with various volumes of Au

2.3 pH对赤藓红SERS的影响

为了得到最佳的表面增强拉曼效果，本文测量了不同pH条件下的表面增强拉曼光谱。如图3所示，用不同浓度的硝酸调节赤藓红与金胶的pH，当混合溶液的pH为5时，赤藓红的SERS信号明显优于其他pH，因此本实验在pH为5的条件下进行研究。改变赤藓红与金胶的混合溶液的pH，将会有助于金胶进行聚合，产生更多的活性位点，使赤藓红分子有效的与金胶进行结合，从而达到更好的表面增强效果。

2.4 不同混合时间对SERS的影响

在实验过程中，随着混合时间的变化，赤藓红的SERS信号强度会有所增加，因此选择了几个时间点研究混合时间对SERS信号的影响。如图4所示，1～10min，SERS信号强度有较为明显的增加;10～15min，SERS信号基本稳定，信号强度不再变化。因此选择将混合溶液放置10min之后再进行SERS测量。在10min以前，赤藓红可能没有与金胶完全结合，所以SERS强度会随时间增加而增加;在10min之后，赤藓红与金胶基本结合完全，因此SERS强度不再变化。

图3 不同pH条件下赤藓红的SERS光谱Fig.3 SERS spectra of erythrosine in different pH system

图4 不同混合时间赤藓红的SERS光谱Fig.4 SERS spectra of erythrosine in different mixing time

2.5 赤藓红表面增强拉曼半定量研究

图5 不同浓度的赤藓红SERS光谱Fig.5 SERS spectra of different concentrations of Erythrosine

将赤藓红与金胶按照体积比1∶1进行混合，然后分别用硝酸将pH调节至5，混合均匀之后，10min时进行SERS测量。由图5可以看出，当赤藓红的浓度降至1mg/kg时仍然可以观察到一部分特征峰，而当浓度降低至0.1mg/kg时，所有的特征峰都已经观察不到，因此本研究中采用表面增强拉曼光谱法检测赤藓红的最低浓度为1mg/kg。图6为赤藓红SERS强度随浓度变化的折线图。可以看出金溶胶在较大范围内对赤藓红均有较为稳定的增强作用。

图6 赤藓红浓度对数与拉曼强度对数的关系Fig.6 Relationship between logarithm of different concentrations and logarithm of SERS intensity of erythrosine

3 结论

本文采用密度泛函理论(DFT)计算了赤藓红的理论拉曼光谱，确定了赤藓红与金胶的体积比1∶1，在pH5的条件下，混合溶液放置10min时，赤藓红的SERS信号最好，检测限可达到1ppm，低于食品中的最大允许添加量。该研究为检测实际食品样品中的赤藓红提供了研究基础，但仍需进一步的研究将其应用到实际样品的检测。

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