郝鹏飞，黄 昀，李 勇，3，陈 娜，丁金祥，4，辛 敏，唐劲天，*

(1.北京中医药大学，北京100102; 2.清华大学工程物理系粒子技术与辐射成像教育部重点实验室，北京100084; 3.兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州730070; 4.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

辣椒(Capsicum spp.)是茄科辣椒属一年生草本植物，在世界范围内广泛种植［1］。目前我国是世界上辣椒栽培面积最大的国家，我国辣椒的总产量已居世界之首，年产量达2800×104t，约为世界辣椒产量的46%，同时每年以9%的速度增长［2］。但目前国内外在采收辣椒果实后，根、茎和叶通常被当做农业垃圾废弃，并没有被有效利用，对资源造成了极大的浪费。据相关研究辣椒叶黄酮类和多酚类化合物含量丰富［3］。其中植物叶多酚具有抗氧化、抗癌、抗过敏、防龋齿、消臭美白、降血压和保护大脑等多种生理功能［4－6］。植物多酚作为天然抗氧化剂已被广泛应用于食品、药品、化妆品及动物饲料添加剂等领域。因此，对辣椒叶中的多酚类物质进行研究和开发利用极具前景。本研究室李勇［7］等人利用超声辅助提取工艺成功高效地从干燥辣椒叶中提取了辣椒叶多酚，提取物中多酚平均得率为12.11mg/g，但产物多酚纯度较低仅为4%，不利于进一步开发和利用。本文在前期研究基础上，着重进行了辣椒叶多酚的纯化工艺研究。本研究首次建立了大孔树脂柱层析法纯化辣椒叶多酚的工艺，并对柱色谱条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣椒叶 2010年10月购自四川省梓潼县，当年采收，通风干燥备用;没食子酸对照品中国药品生物制品检定所;大孔吸附树脂HPD－100、HPD400、HPD－450、HPD－600、HPD－750、HPD－722、HPD－826、D101、DM130、ADS－7、ADS－17、AB－8、NKA－9、X－5沧州宝恩化工有限公司;无水乙醇北京化工厂，分析纯;液体和固体试剂均为国产分析纯试剂，超纯水美国Barnstead Easypure超纯水系统。

WF2 UV－2000型紫外可见分光光度仪 尤尼柯(上海)仪器有限公司;RE－52AA型旋转蒸发仪上海振捷实验设备有限公司、R510型巩义市予华仪器有限责任公司;FDU－2100型冷冻干燥器EYELA(日本产);DZF－6050型真空干燥箱北京神泰伟业仪器有限公司;MOOEL ESJ－6020型电子分析天平梅特勒—托利多(上海)有限公司;Milli－Q Academic型超纯水系统美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 辣椒叶提取液的制备 称取辣椒叶1200g，60%乙醇(pH1)作为提取溶剂，料液比1∶30，在45℃下超声波辅助提取40min，合并滤液，浓缩，冷冻干燥即得。用前新鲜配制成相应浓度的多酚粗提物水溶液［7］(下文简称“粗提液”)。

1.2.2 线性关系及回归方程 精密称取没食子酸对照品5.00mg，置于50mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取此溶液10mL，加入25mL棕色容量瓶中稀释至刻度，作为对照品溶液(没食子酸浓度36.184μg/mL)。然后分别精确吸取没食子酸对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，加入25mL棕色容量瓶中，加1.0mL磷钼钨酸溶液和13mL超纯水，再用29%饱和碳酸钠溶液缓慢稀释至刻度，摇匀，静置反应30min，同时做空白对照。以765nm处的最大吸光度作为没食子酸的检测波长，以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C，μg/mL)为横坐标，绘制出标准曲线［8］，并计算出标准回归方程。

1.2.3 供试溶液多酚含量测定 准确量取供试溶液1.0mL，置于50mL的棕色容量瓶中，加水缓慢稀释至刻度，摇匀。再从中精密量取1.0mL，置于25mL棕色容量瓶中，按照1.2.2方法，从“加1.0mL磷钼钨酸溶液”起，测定吸光度A，代入回归方程，以没食子酸为当量计算出供试液中多酚含量。

1.2.4 静态吸附－解吸实验优选大孔树脂 称取14种已经预处理的大孔吸附树脂各2g于100mL具塞锥形瓶中，加入50mL辣椒叶多酚粗提液(多酚浓度C0为1.611mg/mL)，放置于摇床上，25℃，87r/min振摇2h，静置10h，减压抽滤，测定滤液中多酚浓度Ce。将滤出的大孔树脂抽干，置于100mL具塞锥形瓶中，加入50mL 70%乙醇溶液置于摇床上，25℃，87r/min振摇2h，静置2h，进行静态解吸，并测定解吸液多酚浓度Cd。分别按照以下公式计算14种不同树脂的静态吸附量、吸附率和解吸率。

吸附量(mg/g干树脂)=(C0－Ce)×V0/m;

吸附率(%)=(C0－Ce)×100/C0;

解吸率(%)=Cd×100/(C0－Ce)。

其中m为树脂质量(g);V0为初始辣椒叶多酚粗提液体积(mL)。

1.2.5 色谱条件优化研究

1.2.5.1 上样溶液浓度考察 量取粗提液(多酚含量为1.753mg/mL)200mL，分别加水稀释至多酚含量为1.197、0.603、0.353mg/mL，分别上样于预装的大孔树脂柱(36g;3cm×18cm;床体积约为85mL)，以2BV/h (床体积/小时)流速进行吸附，收集未能吸附在柱上的流出液，按1.2.3方法测算多酚含量，计算出吸附量。

1.2.5.2 树脂柱径高比考察 分别装填径高比为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8的大孔树脂色谱柱，并以2BV/h流速进行吸附(多酚质量浓度为0.833mg/mL)，上样量为3BV，收集未能吸附在柱上的流出液，按1.2.3方法测算多酚含量，计算出吸附量。

1.2.5.3 吸附速率的考察 量取粗提液(多酚浓度为0.860mg/mL)250mL，吸附于85mL(径高比为1∶4) HPD－100树脂柱上，分别以1、2、3、4BV/h的流速进行吸附实验，收集未能吸附在柱上的流出液，按1.2.3方法测算多酚含量，计算出吸附量。

1.2.5.4 上样量的考察 分别量取粗提液(多酚浓度为0.915mg/mL)1、3、5、7、9、11、13、15、17、18、19、20、21、22BV，上样于床体积为85mL的HPD－100树脂柱，以2BV/h流速进行吸附，收集未能吸附在柱上的流出液，按1.2.3方法测算多酚含量。

1.2.5.5 洗脱剂乙醇浓度的考察 量取粗提液(多酚浓度为0.866mg/mL)250mL，上样于床体积为85mL的HPD－100树脂柱，以3BV/h流速进行吸附，再用3BV/h流速水洗5BV后，分别用体积分数为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇溶液洗脱，流速为2BV/h，洗脱剂用量250mL。收集洗脱液，按1.2.3方法测算多酚含量，计算出解析率。

1.2.5.6 洗脱剂用量的确定 将吸附饱和的树脂用70%乙醇，以2BV/h的速度进行洗脱，以1BV为单位分别收集洗脱液，直至洗脱剂用量达到7BV。按1.2.3方法测算多酚含量。

1.2.5.7 水洗体积的考查 用超纯水以5BV/h的流速洗脱吸附饱和的树脂上未吸附的多酚提取液，一次加入1BV的蒸馏水，共加8次，分别收集每一次的洗脱液，按1.2.3方法测算多酚含量。

2 结果与讨论

2.1 线性关系及回归方程

以1.2.2方法测定没食子酸线性关系，得到没食子酸标准曲线方程:y=0.1024x+0.0432，R2= 0.9999。可知，没食子酸浓度在1.648～8.240μg/mL范围内线性关系良好，符合检测要求。

2.2 大孔树脂静态吸附－解吸实验

以1.2.4方法对大孔树脂静态吸附－解吸情况进行考察，结果见表1。

从表1可知，HPD－750、HPD－100、ADS－7和HPD－722型号树脂对辣椒叶多酚具有较强的吸附性能，NKA－9、X－5、HPD－722和HPD－100等解析率效果比较好。综合考虑，其中HPD－100树脂具有较高的吸附率和解吸率。因此，选择HPD－100树脂纯化辣椒叶多酚。

表1 14种大孔树脂静态吸附－解吸情况Table 1 The static adsorption－desorption characteristic of fourteen types of macroporous resin

2.3 色谱条件优化研究

2.3.1 上样浓度的考察 以1.2.5.1方法对上样浓度进行考察，结果见图1。

从图1可以看出，在一定的低浓度范围内(＜0.603mg/mL时)，树脂的吸附量随上样浓度增大而增加。而浓度过高时，树脂的吸附量开始下降。当药液浓度达到1.197mg/mL时，其吸附量呈现明显的下降趋势。可能是由于浓度过高使得吸附时间变长，从而造成一部分先吸附的多酚被后面的样品洗脱下来。因此确定上样的辣椒叶多酚粗提液浓度为应该在0.603～1.197mg/mL之间。

图1 上样浓度的考察Fig.1 Investigation of the sample concentration

2.3.2 树脂柱径高比例考察 以1.2.5.2方法对树脂柱径高比例进行考察，结果见图2。

从图2可以看出，径高比在1∶2～1∶4之间吸附量保持稳定，但到1∶6时吸附量急速减少。推测是因为树脂柱过高，吸附时间相应变长，导致先吸附的多酚被洗脱下来。且增加径高比也会使树脂的堵塞加剧，对生产不利。综上分析，最适径高比为1∶4。

2.3.3 吸附速率的考察 以1.2.5.3方法对吸附速率进行考察，结果见图3。

从图3得知，当吸附速率增加时，其吸附率逐步下降。当吸附速率为3BV/h时，吸附率明显减少。推测的原因是:上样液流速过大时，辣椒叶多酚粗提液中的多酚类物质还未扩散到大孔吸附树脂的内表面，就已经被冲出柱子;而吸附流速太慢时，导致纯化效率过低。因此，较优的吸附速率为2BV/h。

图2 树脂柱径高比例考察Fig.2 Investigation of the resin column diameter to height ratio

图3 吸附速率的考察Fig.3 Investigation of the adsorption rate

2.3.4 上样量的考察 以1.2.5.4方法对上样量进行考察，结果如图4。

从图4可知，上样量从15BV开始，泄露速度趋于稳定，即15～20BV之间多酚的吸附和解析达到动态平衡。因此确定上样量为15BV时，树脂柱已经达到吸附饱和。故确定最佳的上样体积为15BV。

图4 上样量的考察Fig.4 Investigation of the sample volume

2.3.5 洗脱剂浓度的考察 以1.2.5.5方法对洗脱剂浓度进行考察，结果如图5。

从图5可知，当乙醇体积分数为70%时，解吸率达到最大(96.5%)，此时洗脱效果最好。

2.3.6 洗脱剂用量的考察 以1.2.5.6方法对洗脱剂用量进行考察，结果如图6。

从图6可以看出，洗脱剂用量达到3BV时，多酚的洗脱速率基本达到平衡，考虑节约生产中的成本的问题，选取3BV洗脱剂用量较佳。

图5 洗脱剂浓度的考察Fig.5 Investigation of the eluent concentration

图6 洗脱剂用量的考察Fig.6 Investigation of the amount of eluent

2.3.7 水洗体积的考察 以1.2.5.7方法对水洗体积进行考察，结果如图7。

从图7得知，当用水量达到3BV时，可将树脂上绝大部分未吸附的多酚溶液洗脱出来，因此水洗量宜选择3BV。

图7 水洗体积的考察Fig.7 Investigation of the washing volume

2.4 最佳纯化工艺验证实验

为进一步考察实验结果的可靠性和稳定性，按照上述实验所得最佳工艺(树脂柱径高比为1∶4，药液质量浓度在0.6～1.2g/mL之间，吸附速率2BV/h，上样量15BV，上样后先用3BV体积超纯水以5BV/h的流速洗脱除去未吸附的杂质，再用3BV的70%乙醇洗脱)进行3次平行实验，多酚含量依次为66.832%、69.973%、67.211%，平均多酚含量约为68%，说明在此工艺条件下多酚纯度较高，重复性好，工艺稳定可靠。

3 结论

经过对14种大孔树脂的筛选，最终采用HPD－100对辣椒叶多酚粗提物进行纯化。其最佳吸附条件为:树脂柱径高比为1∶4，药液质量浓度在0.6～1.2mg/mL之间，吸附速率2BV/h，上样量15BV。在以上条件下，最佳洗脱条件为:先用3BV体积超纯水以5BV/h的流速洗脱除去未吸附的杂质，再用3BV的70%乙醇洗脱。经上述条件处理后的辣椒叶多酚含量可达到68%。该法简单易行，生产周期短、成本低、所得多酚纯度高、比较完整的保存了多酚天然的生物活性，对工业化生产具有一定的指导意义。

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