赵红玲，高 杨，尹志峰，王良友△，寇 成

(1.承德医学院中药所，河北承德 067000;2.承德民族师范学院)

发酵法生产还原型谷胱甘肽的研究进展

赵红玲1，高 杨1，尹志峰1，王良友1△，寇 成2

(1.承德医学院中药所，河北承德 067000;2.承德民族师范学院)

谷胱甘肽;发酵法;发酵调控过程

谷胱甘肽(Glutathione，简称GSH)是由谷氨酸半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的具有多种重要生理功能的活性三肽。由于其广泛的生物效应，临床上除应用于肝脏疾病治疗外，还应用于恶性肿瘤、神经、泌尿、消化等多种疾病的治疗。GSH作为一种细胞内重要的调节代谢剂和抗氧化剂，已成为多种疾病特别是危重症救治中重要的治疗和辅助治疗药物。GSH是非酶性抗氧化剂，是细胞合成的抗氧化剂，对细胞内自发或酶促反应所产生的活性中间产物可清除、解毒，从而在活体细胞抗氧化物作用中起重要保护作用[1]。

1 谷胱甘肽的生产方法

国内外生产谷胱甘肽的方法有萃取法、化学合成法、化学生物合成法、发酵法、酶法。

1.1 萃取法 GSH的早期生产采用萃取法，一般的工艺流程为:提取-盐析-离子交换(或膜分离)-浓缩-结晶。但GSH在动植物体内含量较低，有机溶剂污染严重、纯度不高，不适合工业化生产。

1.2 酶法 酶催化合成GSH条件:氨基酸原料(L-Glu、L-Cys和Gly)、ATP、保 持GSHI和GSH II活 性、辅 因 子(Mg2+)和一个适当的pH值环境。合成中需求大量ATP，给GSH的工业化生产带来麻烦。

1.3 化学合成法 化学合成法生产谷胱甘肽是将L-Glu、L-Cys和Gly经过基团保护、缩合、脱保护步骤合成GSH。虽然工艺比较成熟，但合成GSH是消旋体，需要进行光学拆分，因此，限制了该方法的广泛应用。

1.4 化学生物合成法 以γ-谷氨酰转肽酶(GGT)为催化剂，以L-谷氨酰胺作为γ-谷氨酰基供体，S-苄基-半胱氨酰甘氨酸作为γ-谷氨酰基受体，进行酶促转肽反应合成S-苄基-谷胱甘肽。S-苄基-谷胱甘肽脱去苄基得谷胱甘肽，该方法有望开辟一条制备谷胱甘肽的新路线[2]。

1.5 发酵法 利用微生物代谢将廉价原料转化为GSH，具有明显的优势。发酵使用的细菌或酵母容易培养，原料容易获得，操作简单，反应条件温和，因此，发酵法已成为目前生产GSH最普遍的方法。

2 发酵法生产GSH

2.1 生产菌株的选育 发酵生产GSH所用菌种中酿酒酵母最为常见，相关的文献报道也最多。酵母细胞中GSH的合成及分解代谢过程已被研究清楚，但酵母细胞的GSH含量较低，存在酵母用量大、收率低等缺点，因此，选育高产GSH的优良菌株十分重要。

2.1.1 常规诱变育种:普通的野生型酵母细胞中GSH的含量并不高，只有采用物理的或化学的方法使出发菌株发生变异，再在特定的培养基中进行筛选培养，使GSH在这种变异菌株的细胞内大量积累，以此实现GSH的高产。国内外已有许多相关的文献报道，诱变效果较为显著的方法和结果见表1。

表1 高产谷胱甘肽菌株的选育方法和结果

2.1.2 基因工程技术:80年代以来，随着基因工程的发展，将基因工程技术手段运用于高产GSH的菌株的构建和菌株代谢调控方面，为获得高产菌株拓展了思路。国内外相关文献报道中的方法和结果见表2。

表2 基因工程菌的构建和产量

其中，沈继朵等[14]人将γ-谷氨酰转肽酶(GGT)和GSHⅡ基因分别构建不同的质粒中，用宿主E．coli BL21表达，GSH产量0.524g/L，此方法成为生产GSH的一条新路线。

2.2 优化发酵工艺 为了进一步提高GSH的产量，优化培养条件，以实现生物量和胞内GSH大幅度积累。

2.2.1 培养基的优化:微生物的生长所需的碳、氮源和无机盐、微量元素对于生物量的累计和目标产物的生成十分关键，有人将先进的数学模型运用到优化实验中。卞芙蓉[15]等应用Plackett Burman设计，对酵母发酵生产谷胱甘肽的培养基10个因素进行优化，选择出显著因素葡萄糖、酵母膏和半胱氨酸，然后用球面对称设计对这3个因素各取5个水平进行优化。在优化条件下，发酵液中谷胱甘肽积累量可达162.3mg/L，比优化前产量提高约56.2%。鲁延迅等[16]人利用谷胱甘肽的总产量与细胞的数量和细胞内谷胱甘肽质量分数关系，通过添加底物Gly、Glu和高渗刺激物KCI促进谷胱甘肽生物合成，提高胞内谷胱甘肽的质量分数。应用球面对称设计优化了实验条件，使得胞内谷胱甘肽质量分数达4.47%，产量达257.3mg/L。

2.2.2 培养条件的优化:温度影响代谢过程中各种酶的活性、代谢反应速率、菌体生长量。氧气浓度影响微生物的生长和GSH合成。卫功元等[17]研究表明，溶氧对产朊假丝酵母发酵生产GSH的影响，当葡萄糖浓度为30g/L，且通气量控制在5L/min时，搅拌转速达到300r/min可满足细胞生长和谷胱甘肽合成对溶解氧的需求。贺小贤等[18]人研究了酿酒酵母突变株YF发酵生产谷胱甘肽的条件，使用Design Expert软件的Plackett-Burman设计法进行分析，利用响应面分析法的中心组合原理，对搅拌转速、通气量和pH这3个影响谷胱甘肽生物合成的3个主要因素进行实验设计和结果回归分析。结果:谷胱甘肽的产量为150.27mg/L。

2.2.3 发酵过程调控:目前，发酵调控应用最多的葡萄糖流加策略有恒速流加、指数流加、反馈控制流加。针对GSH的发酵研究还有前体物补加策略，为了提高产量，适应于工业化的要求，近些年来对于发酵调控的研究比较多(见表3)。

表3 发酵调控研究和结果

通过对葡萄糖流加研究发现，采取后期限量流加葡萄糖的方法，可以消除底物抑制，达到高密度发酵，延长GSH的合成时间。但是，通过在线监测发酵液中溶解氧和乙醇的体积分数，运用反馈控制系统确定葡萄糖的流加速率，使葡萄糖和乙醇同时被利用，进一步提高了发酵过程GSH产量[20]。在前体氨基酸中，半胱氨酸为GSH合成的关键氨基酸，它能明显提高细胞内GSH含量及GSH的比生产速率，但也能阻碍细胞量的增加。在发酵中，补加方式应采取以尽量减少对细胞生长的抑制、后期一次性添加的策略[22]。

3 问题与展望

国内发酵法GSH的生产多处于工业性试验阶段，研究主要集中于上游，如高产菌种的选育，发酵调控实现高密度、高产量，也取得了一些成绩，但是下游存在提取工艺收率低、产品纯度低、成本高、达不到医药级GSH的质量要求的问题。

国内的研发机构也加紧了GSH工业化生产技术的开发，一方面，以高密度发酵技术来提高产量，另一方面是分离提取工艺的进一步创新，以获得优质产品，满足市场需要。例如上海康鹏化学有限公司2011年开发的6吨级固相酶法谷胱甘肽生产线正在进行试产，通过努力，争取研制出年产10吨及以上规模的生产线，以解决国内GSH只能进口的局面，并拓展其应用领域，加速GSH产业的发展。

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