王金保，王 琪，朱海娟，蔡增华，王 媛

（1.中国人民解放军白求恩国际和平医院麻醉科，河北石家庄050082；

2.河北医科大学第四医院感染控制科，河北石家庄050011）

·论 著·

慢性坐骨神经损伤对MCP/DAF双基因重组转染大鼠的行为学影响

王金保1，王 琪1，朱海娟1，蔡增华1，王 媛2

（1.中国人民解放军白求恩国际和平医院麻醉科，河北石家庄050082；

2.河北医科大学第四医院感染控制科，河北石家庄050011）

目的评价慢性坐骨神经损伤对膜辅助因子蛋白（membrame cofactor protein，MCP）/衰变加重因子（decay accelerating facter，DAF）重组转染大鼠的行为学影响，为神经病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）大鼠的治疗探索新的靶标。方法MCP/DAF双基因重组转染SD大鼠24只，体质量200～250kg，按照随机数字表法分为Rsham和RCCI2组（n=12）；健康雄性SD大鼠24只，体质量200～250kg，按照随机数字表法分为Nsham和NCCI2组（n=12）。RCCI组和NCCI组大鼠行右侧坐骨神经4道环形结扎，Rsham组和Nsham组大鼠只暴露右侧坐骨神经，不予环形结扎。分别于术前1d和术后1、3、7d测定大鼠的热痛阈值和机械痛阈值。术后7d测定痛阈值后，立即处死大鼠，取L4～5脊髓组织，其中6只用于免疫组织化学实验（测定OX-42表达），另外6只用于RT-PCR实验（测定MCPmRNA和DAFmRNA）。结果与Nsham组相比，NCCI组大鼠术后1、3、7d热痛阈值和机械痛阈值降低（P＜0.05），脊髓组织中OX-42表达升高（P＜0.05），MCPmRNA和DAFmRNA表达下降（P＜0.05），Rsham组和RCCI组大鼠术后上述时间点热痛阈值和机械痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05），OX-42表达差异无统计学意义（P＞0.05），MCPmRNA和DAFmRNA表达显著升高（P＜0.05）；与NCCI组相比，RCCI组大鼠术后上述时间点热痛阈值和机械痛阈值升高（P＜0.05），脊髓中OX-42表达下降（P＜0.05），MCPmRNA和DAFmRNA表达升高（P＜0.05）。结论MCP/DAF重组转染大鼠可抑制慢性坐骨神经损伤引起的痛觉过敏形成，MCP/DAF可作为NPP治疗的新靶标。

坐骨神经痛；痛阈；大鼠

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）是一组顽固性疾病，由于其发病机制不清，目前缺乏有效治疗手段。研究［1］表明，NPP大鼠脊髓背角发生补体异常活化且膜结合性补体调节蛋白膜辅助因子蛋白（membrane cofactor protein，MCP）、衰变加重因子（decay accelerating factor，DAF）表达下降。那么，改变脊髓中MCP、DAF表达是否能影响NPP的形成，目前尚未见报道。本研究探讨慢性坐骨神经损伤对MCP/DAF重组转染大鼠的行为学影响，旨在为NPP的治疗提供新的靶标。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组：MCP/DAF双基因重组转染SD大鼠（由武汉大学生命科学院提供）24只，体质量200～250kg，按照随机数字表法分为Rsham和RCCI2组（n=12）；健康雄性SD大鼠（由武汉大学生命科学院提供）24只，体质量200～250kg，按照随机数字表法分为Nsham和NCCI2组（n=12）。RCCI组和NCCI组大鼠行右侧坐骨神经慢性压迫性损伤，Rsham组和Nsham组大鼠只暴露右侧坐骨神经。术后7 d测定痛阈值后，立即处死大鼠，取L4～5脊髓组织，其中6只用于免疫组织化学实验（测定OX-42表达），另外6只用于RT-PCR实验（测定MCPmRNA和DAFmRNA）。

1.2 坐骨神经慢性压迫性损伤：RCCI组和NCCI组参照文献［2］介绍的方法行大鼠右侧坐骨神经慢性压迫性损伤。腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后，取俯卧位，固定于自制手术台上，用硫化钠均匀的涂在手术区域，2min后用棉签轻轻擦掉手术区域的毛发，用碘伏消毒2遍后铺洞巾，在股骨外侧上方纵形切开皮肤，顺肌纹钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，游离周围组织，在坐骨神经三叉分支的近端约5mm处，分别用4-0铬制羊肠线环绕坐骨神经干松弛结扎4道，间距约1mm，要求仅留下缢痕而不阻断神经和血供，以引起小腿肌肉轻度颤动反应为宜，然后逐层缝合皮肤。假手术组仅分离暴露右侧坐骨神经干后逐层缝合；所有手术操作均由同一人完成。Rsham组和Nsham组大鼠只暴露右侧坐骨神经，然后逐层缝合。

1.3 痛阈测定：于术前1d（基础值，T0），术后1d（T1）、3d（T2）和7d（T3）测定大鼠机械痛阈值和热痛阈值。参照文献［3］介绍的方法测定机械痛阈。测定前将大鼠置于底为1cm×1cm铁丝网的透明有机玻璃箱内适应15min后，用von Frey纤维丝（Stoelting医疗公司，美国）筛网下部垂直刺激大鼠后肢足底中部，持续时间≤4s，大鼠出现缩足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。测定首先从2g刺激开始，当该力度的刺激不能引起阳性反应，则给予相邻高一级力度的刺激；如出现阳性反应则给予相邻低一级力度的刺激。如此连续进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定4次，每次刺激间隔30s。采用内推法计算诱发大鼠出现50%机械缩足反应的刺激力度为机械痛阈，公式=10 lgX+κδ（X为最后一次刺激力度，κ为不同刺激方式的系数，在内推法的表格中查找，δ为各刺激力度取对数后间距的平均值，δ=0.179）。参照文献［2］介绍的方法测定热痛阈。应用RTY-1型热痛刺激仪（第四军医大学生理教研室研制），将大鼠置于3mm厚的玻璃板上，使用热辐射光源照射右后肢足底中部，记录从照射到出现缩足反应的时间，即热痛阈值。单次照射不超过20s，同一部位刺激的间隔时间为5min，重复3次，取其平均值。

1.4 脊髓水平OX-42表达的测定：于术后7d，每组随机选取6只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉后，经左心室灌注200mL生理盐水和300mL 4%多聚甲醛溶液，充分固定后，纵向剖开椎管，取L4～5节段脊髓组织，固定24h，经脱水、透明、浸蜡包埋后，切片机连续切片厚度为4μm。石蜡切片经二甲苯透明，常规梯度酒精脱蜡，浸入0.01mol/L，pH6.0枸橼酸盐溶液中，加热至98℃进行抗原修复，30min后冷却至室温，3%H2O2去离子水室温孵育20min，正常兔血清封闭液室温孵育20min。采用免疫组织化学方法检测。将切片置入抗OX-42抗体稀释液（1∶10，Chem icon），室温孵育24h；生物素标记相应种属抗体（1∶200，Sigma，博士德公司分装），室温放置2h；生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物（1∶500，Sigma，博士德公司分装），室温浸泡2h。OX-42阳性产物呈蓝色，位于小胶质细胞胞浆。阴性对照以0.01mol/L PBS代替抗OX-42抗体液，亦按生物素化酶复合物法进行染色。结束染色的切片经漂洗后脱水、透明，中性树脂封片，显微镜下观察。应用MIAS医学图像分析系统在高倍镜下（×400）对脊髓背角浅层进行平均灰度分析，每个脊髓标本随机选取5张切片，求其灰度的平均值。

1.5 脊髓MCPmRNA和DAFmRNA表达的测定：采用RT-PCR法检测。取L4～5节段脊髓背角，用Trizon提取总RNA，紫外分光光度仪测定RNA浓度。采用Primer premier5.0软件设计引物，MCP上游引物5'-CTATGTTACAGGACCCTTCGT-3'，下游引物5'-CTCTTAGCACCACAGACCACC-3'，扩增片段为889bp；DAF上游引物5'-CTGAACGGTGAAGTAGGAGGA-3'，下游引物5'-TCAACTAGCCAGTGAGTAAGAG-3'，扩增片段为477bp；PCR反应条件95℃预变性5min后进行如下循环扩增，95℃变性1min，53℃复性2min，72℃延伸1min，共循环30次。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统和凝胶分析系统进行PCR产物扫描和半定量分析，以MCP和DAF的条带积分光密度值与GAPDH条带积分光密度值的比值，表示MCPmRNA和DAF mRNA的表达。

1.6 统计学方法：应用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料以±s表示，分别采用重复测量设计资料的方差分析和单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 行为学结果：坐骨神经慢性压迫损伤后大鼠后肢出现跛行，足呈轻度外翻状，且有时出现如舔舐、悬空等后肢保护现象。各组痛阈值的基础值比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与基础值比较，Rsham组、Nsham组和RCCI组观察期间机械痛阈值和热痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05）；与Nsham组相比，NCCI组术后各观察时间点机械痛阈值和热痛阈值降低（P＜0.05）；与NCCI组相比，RCCI组大鼠机械痛阈值和热痛阈值升高（P＜0.05）。见表1。

2.2 RT-PCR结果：与Nsham组相比，NCCI组MCPmRNA和DAFmRNA表达下降（P＜0.05），Rsham组和RCCI组MCPmRNA和DAFmRNA表达显著升高（P＜0.05）；与Rsham组相比，RCCI组MCPmRNA和DAFmRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与NCCI组相比，RCCI组MCPmRNA和DAFmRNA表达升高（P＜0.05）。见表2。

2.3 免疫组织化学结果：Nsham组、Rsham组和RCCI组大鼠OX-42非特异性染色较浅，OX-42阳性细胞数量少；NCCI组OX-42染色深，OX-42阳性细胞数多。OX-42阳性细胞平均灰度值测定结果显示，与Nsham组相比，NCCI组OX-42表达升高（P＜0.05），Rsham组和RCCI组MCPmRNA和DAFmRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与NCCI组相比，RCCI组OX-42表达降低（P＜0.05）。见表2。

表1 4组大鼠不同时间点热痛阈值和机械痛阈值的比较Table 1 Com parison ofmechanical and thermal pain threshold in different time points in four groups（n=12，±s）

表1 4组大鼠不同时间点热痛阈值和机械痛阈值的比较Table 1 Com parison ofmechanical and thermal pain threshold in different time points in four groups（n=12，±s）

*P＜0.05 vs Nshamgroup #P＜0.05 vs NCCIgroup by ANOVA test

Groups Thermal pain threshold（s）T0T1T2T3Mechanical pain threshold（g）T0T1T2T3Nsham18.1±2.5 14.7±1.7 16.6±2.3 17.8±2.2 15.2±1.9 13.5±3.1 13.8±2.8 14.7±2.5 NCCI17.5±1.9 13.8±3.2*11.6±2.1*10.9±3.0*14.8±3.2 7.6±1.9*8.8±2.5*8.2±1.4*Rsham17.7±2.9 14.9±2.2 16.8±1.8 17.4±3.5 15.6±2.0 13.8±1.5 15.4±2.2 15.3±1.7 RCCI17.9±3.6 14.3±2.2 16.1±3.2#16.8±2.7#15.4±3.0 13.2±1.5#15.8±1.5#14.9±2.3#

表2 4组大鼠脊髓背角OX-42阳性细胞平均灰度值和脊髓组织MCPm RNA、DAFm RNA表达的比较Table 2 Comparison of OX-42 positive cell，MCPmRNA and DAFm RNA in four groups (n=6，±s）

表2 4组大鼠脊髓背角OX-42阳性细胞平均灰度值和脊髓组织MCPm RNA、DAFm RNA表达的比较Table 2 Comparison of OX-42 positive cell，MCPmRNA and DAFm RNA in four groups (n=6，±s）

*P＜0.05 vs Nshamgroup #P＜0.05 vs NCCIgroup by ANOVA test

Groups MCPmRNA DAFmRNA OX-42 positive cell Nsham1.12±0.23 1.15±0.26 155±17 NCCI0.51±0.20*0.49±0.37*179±26*Rsham1.48±0.22 1.52±0.46 154±25 RCCI1.53±0.33#1.49±0.29#157±21#

3 讨 论

补体异常活化在许多疾病的发生发展过程中发挥重要作用，以补体调节蛋白为靶标抑制补体活化是治疗疾病的策略之一［4-8］。大量研究［1，9-10］表明，NPP大鼠脊髓背角发生补体异常活化，以补体调节蛋白为靶标来治疗NPP值得研究。

本研究采用武汉大学生命科学院提供的MCP/DAF双基因重组转染SD大鼠，是利用人补体调节蛋白基因DAF和MCP整合在转化的SD大鼠神经细胞的染色体上，连续传代30次获得的MCP/DAF双基因重组转染SD大鼠。RT-PCR测定显示，MCP/DAF双基因重组转染SD大鼠脊髓中MCPmRNA和DAFmRNA表达显著高于正常SD大鼠。提示本研究采用的MCP/DAF双基因重组转染SD大鼠是可靠的。

慢性坐骨神经压迫损伤是研究NPP的经典模型，本研究参考文献采用铬制羊肠线4道环形结扎手段实现大鼠右侧坐骨神经慢性压迫性损伤，结果显示，损伤侧后爪收拢，不敢着地，热痛阈值和机械痛阈值均明显减低，提示本研究制作的坐骨神经慢性压迫性损伤是成功的。OX-42是小胶质细胞的特异性标记物，在静止状态下，小胶质细胞很少表达OX-42，只有在激活状态，小胶质细胞大量表达OX-42，本研究通过观察OX-42的表达来了解大鼠脊髓背角小胶质细胞的活化情况。

本研究结果显示，慢性坐骨神经压迫损伤后，没有诱发MCP/DAF双基因重组转染SD大鼠产生痛觉过敏现象。而正常SD大鼠在慢性坐骨神经压迫损伤后出现明显的痛觉过敏现象；本研究中还采用免疫组织化学手段观察脊髓中小胶质细胞活化情况，结果显示MCP/DAF双基因重组转染SD大鼠慢性坐骨神经压迫损伤后脊髓背角没有发现明显的小胶质细胞活化，而正常SD大鼠在慢性坐骨神经压迫损伤后出现明显小胶质细胞活化现象。提示MCP/DAF的表达改变可影响大鼠遭遇外周神经损伤后脊髓中小胶质细胞的活化，进而影响大鼠痛觉过敏的形成。DAF和MCP为膜结合型补体调节蛋白，它们可阻断补体级联反应，保护宿主细胞免受伤害。NPP大鼠脊髓背角发生了补体异常活化，活化的补体蛋白不仅激活小胶质细胞，而且影响脊髓背角感觉神经元的兴奋性，促使神经元释放大量兴奋性神经递质，这些兴奋性神经递质通过突触间隙作用于突触后神经元，使伤害性信息不断上传，经过大脑的信息整合，产生痛觉过敏现象［10］。MCP/DAF双基因重组转染大鼠其MCP/DAF表达增加，阻断脊髓背角补体级联反应，从而抑制NPP的形成。

综上所述，MCP/DAF双基因重组转染大鼠可抑制外周神经损伤引起的痛觉过敏。表明提高脊髓中MCP/DAF的表达，可在一定程度上对NPP治疗发挥作用。本研究只是为NPP的治疗靶标提供新思路，如何治疗NPP还有待进一步研究。

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（本文编辑：赵丽洁）

EFFECT OF CHRONIC CONSTRICTIVE INJURY TO SCIATIC NERVE ON MCP-DAF TRANSGENIC RAT

WANG Jinbao1，WANG Qi1，ZHU Haijuan1，CAIZenghua1，WANG Yuan2
(1.Department of Anesthesiology，Bethune International Peace Hospital of PLA，Shijiazhuang 050082，China；
2.Department of Infection Control，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo investigate the effect of chronic constrictive injury（CCI）to sciatic nerve on the behavior of MCP-DAF transgenic rats，and to find a new way to treat neuropathic pain（NPP）.MethodsTwenty-four MCP-DAF transgenic SD rats weighting 200-250kg were randomly divided into two groups（n=12）Rshamgroup and RCCIgroup，while twenty-four adult male SD rats weighting 200-250kg were randomly divided into two groups（n=12）：Nshamgroup and NCCIgroup. Sciatic nerve on one side was exposed and 4 loose ligatures were placed on the sciatic nerve at 1 mm intervalswith 4-0 catgut in rat in NCCIgroup and RCCIgroup.Mechanical and thermal pain threshold were measured by paw withdrawal latencies to von frey hair and radiant heat stimulation at1 d before operation（baseline）and 1，3，7 d after operation.The animals were killed at 7 d after operation and the L4-5segment of the spinal cord was removed for determination of expression of membrane cofactor protein（MCP）mRNA and decay accelerating facto（r DAF）mRNA（by reverse-transcription PCR［RT-PCR］）and OX-42（by immuno-histochemistry）.Resultscompared with Nshamgroup，the pain threshold was significantly decreased in NCCIgroup and no obvious change in rats in Rshamgroup and RCCIgroup；the expression of MCP mRNA and DAF mRNA were significantly decreased in spinal cord in rats in NCCIgroup，and were increased in Rshamgroup and RCCIgroup；the expression of OX-42 in spinal cord was obviously increased in rats in NCCIgroup，but had no significant change in Rshamgroup and RCCIgroup. Conclusion The hyperalgesia was not induced by chronic constrictive injury to sciatic nerve in MCPDAF transgenic rats，which can offer a new way to treat the NPP.

sciatic neuropathy；pain threshold；rats

R735.7

A

1007-3205（2013）09-0997-04

2013-02-25；

2013-04-17

国家自然科学基金资助项目（30772077），河北省自然科学基金资助项目（2010001881）

王金保（1974-），男，河南卫辉人，中国人民解放军白求恩国际和平医院主治医师，医学硕士，从事神经病理学疼痛发病机制研究

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.09.003