陈倩倩 李 清 毕开顺

沈阳药科大学中药学院中药质量控制技术国家地方联合工程实验室，辽宁 沈阳 110016

茵陈为菊科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陈蒿Artemisia capillaris Thunb.的干燥地上部分。春季幼苗高6～10cm时采收或秋季花蕾长成花除开时采割，除去杂质及老茎，晒干。春季采收的习称“绵茵陈”［1］。绵茵陈药理作用广泛，具有抗病原微生物、保肝利胆、镇痛消炎、降血脂、增强免疫、抗肿瘤等方面的活性［2］。临床上常用茵陈蒿汤或茵陈蒿汤加减治疗各种尤其是伴有细菌性感染的肝胆疾病［3］。

穿心莲为爵床科植物穿心莲 Andropraphis paniculata (Burm.f.)Nees的干燥地上部分［4］。梁汝坚等［5］观察穿心莲内酯注射液对成年重型上呼吸道感染有明显的疗效，同时使上呼吸道感染的病程明显缩短。另据报道，穿心莲内酯类还具有抑制表皮细菌感染等功能［6］。此外，有文献指出穿心莲对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都表现出不同程度的敏感性［7－8］。

临床上，绵茵陈和穿心莲配伍的处方比较多，本试验旨在考察二者配伍后对不同类型测试菌的抑制作用，并优化出抗菌效果最佳的配伍比例，为下一步临床用药提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 绵茵陈、穿心莲购自沈阳同仁堂药房。经沈阳药科大学贾英副教授鉴定均为正品。灭菌蒸馏水为实验室自制。

1.2 培养基 琼脂 (上海楚柏实验室设备有限公司)，MH肉汤 (杭州天和微生物试剂有限公司)，液体沙氏培养基(北京奥科试剂有限公司)，沙氏琼脂培养基 (北京奥科试剂有限公司)，抑菌圈测量仪 (北京先驱威锋技术开发公司)。

1.3 仪器与设备 BJ－1CD超净工作台，IKA RV10V/IKA RV10V－C旋转蒸发仪，LDZX－75KBS立式自动电热压力蒸汽灭菌器，HZQ2F全温振荡培养箱。

1.4 菌种及培养条件 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus)、大肠杆菌 (Escherichia)和白色念珠菌 (Candida albicans)均购自中国食品药品检定研究院。前两种为革兰氏阳性菌，大肠杆菌为革兰氏阴性菌，白色念珠菌为真菌。除白色念珠菌于沙氏琼脂中28℃培养2 d外，其余菌种均于琼脂培养基37℃培养24 h活化，备用。

1.5 方法

1.5.1 植物提取物的制备 将干燥的穿心莲药材，粉碎，过40目筛。取药材粉末10 g，用200 ml蒸馏水回流提取2 h，过滤，残渣用50 ml蒸馏水回流提取0.5 h，过滤，合并两次提取液，减压干燥浓缩成粉末，称重，用灭菌蒸馏水稀释成每毫升含100 mg原药材的水提取液，干燥低温保存，备用。

按上述方法制得相同浓度的绵茵陈水提取液。

绵茵陈、穿心莲按照1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，2∶1，3∶1，4∶1的质量比称取药材混合粉末共10 g，按上述方法制得每毫升含有100 mg混合原药材的水提取液。

1.5.2 菌悬液的制备 将上述活化后的供试菌种，用比浊法确定菌量至0.5麦氏比浊管浊度，再用MH肉汤稀释，使其含菌量约为1×107CFU/m1，作为菌悬液，备用。

1.5.3 最低抑菌浓度 (MIC)的测定 采用8排12孔的一次性培养板，标记后在每排1－11孔中各加入MH肉汤100 μl，1－10以及12号孔各加入100 μl菌悬液。每排1号孔加入原药液100 μl，用MH肉汤采用两倍稀释法稀释，使得1－10孔含药浓度分别为 50.0、25.0、12.5、6.25、3.13、1.57、1.79、0.39、0.20、0.10 mg/ml，第11孔为纯肉汤对照，第12孔为纯测试菌对照。将培养板于37℃培养24 h。肉眼观察细菌生长情况，培养液澄清的为阴性 (即无细菌生长)，培养液混浊的为阳性 (即有细菌生长)。以此确定药液的MIC值。实验重复三次取平均值。

1.5.4 最低杀菌浓度 (MBC)的测定 分别从上述实验中肉眼观察培养液阴性的孔中取50 μl，移种至相应培养基的琼脂板上。37℃恒温培养24 h。观察记录菌落数。菌落数小于3的最低浓度即为药材的最低杀菌浓度 (MBC)。实验重复三次取平均值。

1.5.5 茵陈和穿心莲配伍后抑菌活性 茵陈和穿心莲配伍后抑菌活性的测定采用琼脂扩散法。用无菌棉签蘸107CFU/ml的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌的菌悬液，分别在两块琼脂平板表面均匀涂抹三次，再用无菌棉签蘸1×107CFU/ml的白色念珠菌的菌悬液于沙氏琼脂平板表面均匀涂抹三次，盖好平皿，室温干燥5 min，滤纸片10枚 (直径6.0 mm)平放于无菌平皿内，标记为1－10号。在1－7号滤纸片分别滴加七种两药材不同配伍比例水提取液20 μl，8号滴加茵陈的水提取液20 μl，9号滴加茵陈的水提取液20 μl，10号滴加灭菌蒸馏水滴加茵陈的水提取液20 μl，以上室温自然晾干，用无菌镊子将样片平铺于平板表面，于37℃培养24 h后用抑菌圈测量仪测量抑菌直径。实验重复三次取平均值。

2 结果

2.1 两种药材水提物的MIC、MBC值 绵茵陈和穿心莲的水提物对4种测试菌的MIC值和MBC值见表1和表2。

表1 两种药材水提物对四种测试菌的MIC值

表2 两种药材水提物对四种测试菌的MBC值

结果显示，绵茵陈水提物对大肠杆菌的抑菌和杀菌作用最强，其MIC和MBC分别为0.39 mg·ml－1和6.25 mg· ml－1。而穿心莲水提物对大肠杆菌的抑菌作用最强，MIC为1.72 mg·ml－1，对金黄色葡萄球菌的杀菌作用最强，MBC为10.4 mg·ml。绵茵陈水提物对真菌白色念珠菌有一定的抑制作用，MIC为12.5 mg·ml－1，但是穿心莲水提物对其未见抑制作用。

2.2 茵陈和穿心莲配伍后抑菌活性结果 采用琼脂扩散法测得的两种药材单煎以及配伍共煎水提物的抑菌作用见表3。

表3 单味药材及配伍后水提物的抑菌效果

由表3可见，绵茵陈和穿心莲配伍水提物对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果均强于单味药水提物，说明二者配伍后对细菌的抑制均有不同程度的协同效应。绵茵陈与穿心莲以1:1配伍共煎时对两种革兰氏阳性菌的抑制作用最强，两者以3∶1配伍共煎时对大肠杆菌和白色念珠菌抑制作用最强。由于前面实验显示穿心莲没有对白色念珠菌的抑制作用，两者配伍后的水提物对其抑制作用有所增加，但是效果不是很明显。

为进一步验证两药材以最佳配伍比例配伍后水煎液抗菌效果和单煎液相比是否存在显著性差异，采用SPSS 19.0软件进行独立样本t检验，结果表明共煎液绵茵陈和穿心莲绵茵陈配伍共煎时比二者分别单煎时对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑制作用明显增强，具有显著性差异。

3 讨论

众所周知，具有抗菌作用的中药材是“天然的抗生素”。近年来随着合成与半合成抗菌素的增多和广泛使用，细菌耐药性问题日趋严重，已成为21世纪全球关注的热点［9］由于具有不良反应小，鲜有细菌耐药性等自身特点，其开发利用广阔。而药材之间配伍使用能大大扩大抗菌谱和抗菌能力，有关这方面的研究甚少。

本实验旨在研究绵茵陈和穿心莲两种中药材各自及配伍后的水提物的体外抑菌作用，从而筛选出抗菌活性最强的药材配伍比例，为临床用药提供依据。选择了金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和白色念珠菌，这4种微生物分别代表了革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌，具有一定的代表性。实验测得的两种药材水提物的MIC和MBC表明，绵茵陈的水提物对以上各种测试菌都有抑菌、杀菌作用;穿心莲的水提物对前三种菌有较强的抑菌杀菌作用但是对真菌白色念珠菌未见抑制作用，对其他真菌的作用有待进一步研究。

试验中采用了琼脂扩散法来比较考察两种药材单煎和共煎水提物对上述测试菌的抑菌作用。结果表明，二者配伍后的水提物对测试菌的抑制作用均有不同程度的提高，其中二者1:1配伍时对两种革兰氏阳性菌的抑制作用最强;绵茵陈与穿心莲质量比3:1配伍时对大肠杆菌和白色念珠菌抑制作用最强。本文考察的事水煎剂型，与临床常用的服药剂型相同，结果具有可借鉴性。有关两者配伍使用后药效成分的变化，在后续试验中将做进一步研究。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:223

［2］谢韬，梁敬钰，刘净.茵陈化学成分和药理作用研究进展［J］.海峡药学，2004，16(1):8—13.

［3］盂繁钦，吴宜艳，雷涛.茵陈的药理作用及临床应用进展［J］.牡丹江医学院学报，2009，30(1):46—47

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:251－252

［5］梁汝坚.穿心莲内酯治疗上呼吸道感染疗效观察［J］.广东医学，1998，19(6):473

［6］《全国中草药汇编》编写组.中国中草药汇编 (上、下册)［M］.北京:人民卫生出版社，1976.

［7］Gupt a K K，Aneja S C，Dhar K L.Flavonoids of Andrographis Panic ulata［J］.Phytochemist ry，1983，22(1):314－315.

［8］Koteswara Rao Y，Vimalamma G，Venkata Rao C.Flavonoids and andrographolides f rom Andrographis Paniculata［J］.Phytochemist ry，2004，65:2317－2321.

［9］陈代杰.抗菌药物与细菌耐药性［M］.上海:华东理工大学出版社，2001.