朱祖成

湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000

丹皮酚对氧应激致HSC－LX2细胞
TGF－β1及Smad4表达的影响

朱祖成

湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000

目的：研究丹皮酚对氧应激致人源肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC）LX2增殖及TGF－β1、Smad4和Collagen ImRNA表达的影响。方法：在建立体外过氧化氢（H2O2）致HSC－LX2细胞氧应激模型基础上，用MTT法检测丹皮酚对HSC－LX2细胞增殖的影响，生化检测HSC－LX2细胞内MDA及SOD，荧光定量PCR检测丹皮酚对氧应激致HSC－LX2细胞TGF－β1、Smad4和Collagen I mRNA表达的影响。结果：丹皮酚呈剂量依赖性抑制H2O2诱导HSC－LX2增殖，抑制细胞MDA含量及增加SOD活性，以50μmol/L浓度时最为明显，与DMSO组比较差异有显著性（P＜0.01）；丹皮酚各剂量组作用24 h后，HSC－LX2细胞中TGF－β1、Smad4和Collagen I mRNA的水平降低，与DMSO组比较（P＜0.01），且作用呈剂量依赖性。结论：丹皮酚预处理肝星状细胞可下调TGF－β1、Smad4mRNA的表达，进而抑制肝星状细胞Collagen I的合成，发挥抗肝纤维化作用。

丹皮酚；过氧化氢；人肝星状细胞；肝纤维化

丹皮酚（Paeonol）又称牡丹酚，分离自中药牡丹、芍药的干燥根皮和徐长卿的根或全草，具有较广药理作用，且具有抗过敏与抗炎、抗心肌缺血再灌注损伤、抗神经系统的氧化应激损伤、抗肿瘤作用等作用［1，2］。近年研究表明丹皮酚显著抑制乙醇灌胃大鼠的酒精性肝损害，降低血清转氨酶水平、减少肝细胞脂肪变性和炎性细胞的浸润及肝细胞的凋亡，有较好的护肝作用［3］。为进一步研究其药理作用机制，本实验在建立体外过氧化氢（H2O2）致人源性肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC）LX2细胞系氧应激的基础上，观察丹皮酚对氧应激HSC－LX2细胞增殖及TGF－β1、Smad4和Collagen ImRNA表达的影响，探讨丹皮酚抗肝纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 人源性肝星状细胞系HSC－LX2，购于江苏博慧斯生物技术有限公司。

1.2 药物及试剂 丹皮酚（中国药品生物制品检定所，纯度为98%，批号111532－201005）；30%H2O2（美国Sigma公司，批号H3410）；MTT（美国Sigma公司，批号M2128）；Prime-Script RT reagent Kit，SYBR Premix Ex TaqTM（日本Takara公司）；DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）。

1.3 主要仪器 ABI7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）Thermo Scientific Series 8000二氧化碳培养箱、Thermo Multiskan MK3型酶标仪（美国Thermo公司）；DU640紫外分光核酸蛋白分析仪（美国BECKMAN公司）；SW－CJ－2FD型超净化工作台（苏州苏净集团安泰公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 HSC－LX2细胞置于含10%胎牛血清DMEM培养液，5%CO2、37℃培养箱常规培养，隔天换液，每3d传代一次，每次试验均在呈指数生长的细胞中进行。

2.2 药品配制 将丹皮酚33.2mg溶于5mL 50%DMSO，得到浓度为20mmol/L的母液，0.22μm的滤头过滤后置于－20℃储存。临用时用完全培养基配制成为浓度为1.0mmol/L的工作液。

2.3 细胞模型 分别取待传代的HSC－LX2用10%FBSDMEM培养基稀释成1×105个/ml或5×105个/ml密度接种到96孔板或6孔培养板中，待细胞贴壁后，继续培养至细胞融合约70%左右，换为含1%胎牛血清的DMEM培养基继续培养24h，使细胞生长同步化，培养细胞用PBS洗3遍，用终浓度为0.1mmol/LH2O2共同孵育2h，用PBS洗3遍，然后进行实验。

2.4 细胞分组 随机分6组，①空白对照组：加入含1%胎牛血清的DMEM培养液，培养24h；②DMSO组，含0.1%DMSO的1%胎牛血清的DMEM培养液培养24h；③H2O2模型组：含1%胎牛血清的DMEM培养液加入0.1mmol/LH2O2共同孵育2h，培养24h；④～⑥低、中、高剂量丹皮酚组：用终浓度为0.1mmol/LH2O2共同孵育2 h，加入终浓度分别为0.5、5和50μmol/L丹皮酚，共同培养24h，进行检测。

2.5 MTT法测定丹皮酚对氧应激致HSC－LX2细胞增殖的影响 取对数期生长的细胞接种于96孔板，每孔1×105个细胞，细胞融合约70%时，弃去培养基，换含1% 的DMEM培养24h后，用终浓度为0.1mmol/l H2O2共同孵育2 h，更换为用1%胎牛血清的DMEM培养基稀释的终浓度为0.5、5和50μmol/L丹皮酚，共同培养24h后，各组每孔加入5mg·ml－1的MTT溶液20μl，孵育4h，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，在酶联免疫检测仪上测定各组在490 nm波长光吸收值（OD值）。设不加细胞只加孵育液的空白对照。以溶媒DMSO组为对照孔，取各组8孔平均OD值计算抑制率，抑制率＝（对照孔A490－实验孔A490）/对照孔×100%，实验重复三次。

2.6 生化检测 实验结束后，用南京建成生物工程研究所试剂盒分别测量各组MDA、SOD的活性。

2.7 荧光定量PCR法检测TGF－β1、Smad4和Collagen I mRNA的表达 实验结束后，采用TRIzol法抽提细胞中总RNA，用核酸蛋白测定仪测定RNA含量及纯度，A260/A280均在1.8～2.0之间。取cDNA5μg，采用M－MuLV逆转录酶将其逆转录成cDNA，根据GenBank查找基因序列并自行设计引物，GAPDH上游引物5′－GGATTTGGTCGTATTGGG－3′，GAPDH下游引物5′－GGAAGATGGTGAT GGGA TT－3′；Collagen I上游引物5′－CCCGGGTTTCAGAGACAACTTC－3′，Collagen I下游引物5′－TCCACATGCTTTATTCCAGCAATC－3′，TGF－β1上游引物5′－GCGACTCGCCAGAGTGGTTA－3′，TGF－β1下游引物5′－GTTGATGTCCACTTGCAGTGTGTTA－3′，Smad4上游引物5′－CAGCACTACCA CCTGGACTGGA－3′，Smad4下游引物5′－CTGGAATGCAAG CTCATTGTGAA－3′，PCR扩增反应条件：95℃预变性30sec，5℃变性5sec，60℃退火30s，72℃延伸1min，共反应40个循环。实验结束后，利用ABI 7500数据分析软件对每个样品的荧光定量PCR反应结果进行分析并得到Ct值。参考文献［4］采用2－ΔΔCt方法对TGF－β1及Smad4基因的表达水平进行定量，GAPDH为内参，以DMSO组为对照组并设为基础表达，计算出各组mRNA相对表达情况，实验重复三次。

3 结果

3.1 丹皮酚对氧应激致HSC－LX2细胞增殖的影响 DMSO组与空白组对HSC－LX2无明显抑制作用，与DMSO组比，H2O2模型组可促使HSC－LX2细胞增殖37.7%，而丹皮酚呈剂量依赖性抑制HSC－LX2细胞增殖，抑制率分别为23.5%、41.0%和67.5%，以50μmol/L浓度时最为明显，与H2O2模型组比较差异有显著性（P＜0.01），见表1。

表1 丹皮酚对氧应激致HSC－LX2细胞增殖的影响（±s，n＝8）

表1 丹皮酚对氧应激致HSC－LX2细胞增殖的影响（±s，n＝8）

注：与DMSO组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与H2O2模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

/100%空白组组别 剂量（μmol·L－1） OD 抑制率0 50 0.312±0.036＃＃ 67.5 0.961±0.093 －DMSO组 0 0.959±0.091 －H2O2模型组 0 1.352±0.115**－37.7%丹皮酚低剂量组 0.5 0.734±0.072＃ 23.5丹皮酚中剂量组 5 0.531±0.057＃＃ 41.0丹皮酚高剂量组

3.2 丹皮酚对氧应激致HSC－LX2细胞MDA及SOD的影响 DMSO组与空白组对HSC－LX2细胞MDA及SOD无明显影响，与DMSO组比，H2O2模型组可促使HSC－LX2细胞MDA升高约4.3倍，而SOD下降约87%，与H2O2模型组比，丹皮酚呈剂量依赖性使MDA下降，而SOD呈剂量依赖性升高，以50μmol/L浓度时最为明显，与H2O2模型组比较差异有显著性（P＜0.01），见表2。

表2 各组对氧应激致HSC－LX2细胞MDA及SOD的影响（±s，n＝8）

表2 各组对氧应激致HSC－LX2细胞MDA及SOD的影响（±s，n＝8）

注：与DMSO组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与H2O2模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别 剂量（μmol/L）MDA（umol/L） SOD（IU/L）0.13±0.02 87.25±10.89 DMSO组 0 0.15±0.03 88.31±10.13 H2O2模型组 0 0.79±0.07**11.76±1.63**丹皮酚低剂量组 0.5 0.54±0.05＃ 28.37±2.15＃＃丹皮酚中剂量组 5 0.39±0.04＃＃ 41.78±4.53＃＃丹皮酚高剂量组空白组0 50 0.22±0.03＃＃57.67±5.78＃＃

3.3 丹皮酚对氧应激致HSC－LX2细胞TGF－β1、Smad4和Collagen ImRNA表达影响 采用2－ΔΔCt方法的公式进行计算，得到相对于DMSO组TGF－β1、Smad4和Collagen I的mRNA相对表达量，结果显示：DMSO组有一定量TGF－β1、Smad4和Collagen I的mRNA表达，而与DMSO组比，H2O2模型组可诱导这三种基因显著升高（P＜0. 01）；经丹皮酚作用24 h后，HSC－LX2细胞TGF－β1、Smad4和Collagen I的mRNA含量较DMSO组均下降（P＜0.01），见表3。

表3 丹皮酚对HSC－LX2细胞α－SMA和Collagen I的mRNA表达影响（±s，n＝6）

表3 丹皮酚对HSC－LX2细胞α－SMA和Collagen I的mRNA表达影响（±s，n＝6）

注：与DMSO组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与H2O2模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

Smad4 Collagen I空白组组别 剂量（μmol·L－1） TGF－β1 0 50 0.52±0.01＃＃ 0.43±0.03＃＃ 0.31±0.02＃＃0.99±0.15 0.99±0.12 1.00±0.09 DMSO组 0 1.00±0.14 1.00±0.13 1.00±0.08 H2O2模型组 0 1.37±0.13** 1.64±0.15** 2.01±0.11**丹皮酚低剂量组 0.5 0.96±0.03＃＃ 0.89±0.09＃＃ 0.79±0.05＃＃丹皮酚中剂量组 5 0.71±0.07＃＃ 0.61±0.07＃＃ 0.50±0.03＃＃丹皮酚高剂量组

4 讨论

目前肝纤维化的形成仍然不清楚，近年来研究表明肝星状细胞在肝纤维化过程中起中心环节的作用，在各种损肝因子引起肝细胞损伤、氧自由基、坏死、凋亡及肝组织炎症反应等刺激下，HSC被激活，转化为肌成纤维细胞，发生表型及功能改变，并表达α－SMA，继而使肝脏细胞外胶原和蛋白多糖等细胞外基质生成增加而降解减少，最终导致肝脏胶原沉积与纤维化［5］。在肝纤维化形成过程中氧自由基及其引起的脂质过氧化具有重要作用。脂质过氧化产物可直接激活肝星状细胞，介导HSC的分化、增殖和胶原合成，抗氧化剂能够抑制HSC的活化、增殖和胶原的沉积，已证明H2O2引起的肝纤维化与脂质过氧化有关［6］，本实验用H2O2与HSC在体外共同培养，诱导氧应激，促进肝星状细胞增殖，是较理想的肝纤维化的模型。丹皮酚呈剂量依赖性依赖性抑制HSC－LX2细胞增殖，使肝星状细胞内MDA下降，而使肝星状细胞内SOD呈剂量依赖性升高，以50μmol/L浓度时最为明显。以往的研究表明丹皮酚具有抗神经系统的氧化应激损伤［7］，以上结果提示丹皮酚抗肝纤维化作用机制之一可能与其能抑制HSC的增殖，抑制脂质过氧化有关。

肝星状细胞活化中，TGF－β是肝内最强的诱导纤维化发生的细胞因子之一，TGF－β1是TGF－β家族中调节效应最为显著的成员，也是目前在各种生理、病理过程中研究最为广泛的TGF－β［5］。肝损伤时HSC、枯否细胞及其他细胞通过自分泌或旁分泌的方式产生大量的TGF－β，激活的TGFβ，通过与细胞膜上的Ⅰ型和Ⅱ型受体结合激活Smads蛋白并形成复合物，由此转入核内与各种转录因子相结合，从而调控基因转录［8］。研究表明Smads蛋白是目前所知的唯一的I型受体胞内激酶的底物。Smads蛋白介导了TGF的－胞内信号转导。目前已知至少9种Smads蛋白，分为3类：受体依赖性Smad蛋白（Smadl/Smad2/Smad3/Smad8等）；其介质性Smad蛋（Smad4）；抑制性Smad蛋白（Smad6/Smad7）。Smads介导TGF－β超家族受体到核基因的信号传递，smad4为其通用型smad蛋白，为TGF－β信号传导通路所必须的下游中介分子，TGF－B信号传导通路对肝纤维化的形成和发展有十分重要的作用［9］。本研究运用一种可信、准确而相对经济的实时定量PCR技术，检测了丹皮酚对人肝星状细胞中TGF－β1及Smad4的mRNA表达的影响。结果发现以不同浓度的丹皮酚孵育24h后，能显著抑制HSC－LX2内TGF－β1及Smad4的mRNA表达，呈现剂量依赖性，进而抑制Collagen I。表明明丹皮酚抗肝纤维化作用机制之一是从mRNA水平抑制TGF－β1/Smad4通路，进而抑制细胞外基质如Collagen I等发挥抗肝纤维化作用。

5 结论

丹皮酚预处理肝星状细胞可下调 TGF－β1、Smad4mRNA的表达，进而抑制肝星状细胞Collagen I的合成，发挥抗肝纤维化作用。

［1］吕成明，刘海燕.丹皮酚的药理作用研究进展［J］.医药导报，2005，24（2）：142－143.

［2］杨正生，彭振辉，姚青海，等.丹皮酚的药理作用研究进展［J］.中国药物与临床，2011，11（5）：545－547.

［3］Hu S，Shen G，ZhaoW，etal.Paeonol，themain active principles of Paeonia moutan，ameliorates alcoholic steatohepatitis in mice［J］.J Ethnopharmacol，2010，128（1）：100－106.

［4］Liu W，Saint D A.A new quantitativemethod of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics［J］.Anal Biochem，2002，302（1）：52－59.

［5］Atzori L，PoliG，Perra A.Hepatic stellate cell：a star cell in the liver［J］. Int JBiochem Cell Biol，2009，41（8－9）：1639－1642.

［6］Ceni E，Crabb DW，FoschiM，etal.Acetaldehyde inhibits PPARgamma via H2O2－mediated c－Abl activation in human hepatic stellate cells［J］.Gastroenterology，2006，131（4）：1235－1252.

［7］Du Q，Feng G Z，Shen L，et al.Paeonol attenuates airway inflammation and hyperresponsiveness in amurinemodel of ovalbumin－induced asthma［J］.Can J Physiol Pharmacol，2010，88（10）：1010－1016.

［8］Friedman S L.Evolving challenges in hepatic fibrosis［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2010，7（8）：425－436.

［9］Brenner D A.Molecular pathogenesis of liver fibrosis［J］.Trans Am Clin Climatol Assoc，2009，120：361－368.

Effects of paeonol on expression of TGF－β1 and Smad4 in human hepatic stellate cells activated by Oxidative Stress

ZHU Zu－cheng
Medical School of Hubei University for Nationalities，Enshi445000，China

Aim：To investigate the effect of paeonol on the expression of TGF－β1，Smad4 and Collagen ImRNAinhuman hepatic stellate cells（HSC－LX2）activated by H2O2.M ethods：HSC－HSC－LX2 were cultured in vitro，stimulated by H2O2for 2 hours and treated with different concentrations of paeonol for24 hours，MTT assay was used to evaluate the inhibitive effectof paeonol. The expressions of TGF－β1，Smad4 and Collagen ImRNA were determined by Real－time quantitative PCR.ResultsDifferent concentration of paeonol inhibited the activation and proliferation of HSC－LX2，in a dose dependentmanner.The inhibitive effect was most obvious in 50μmol/L.he expressions of TGF－β1，Smad4 and Collagen Iweremarkedly reduced by the treatment with three concentrations of plumbago than that in the leptin group，and was dose dependent.ConclusionThe expressions of TGF－β1，Smad4 can be down－regulated by paeonol，resulting in the reduced synthesis of Collagen I，which may be one of the possible molecular mechanism against hepatic fibrosis.

paeonol；H2O2；human hepatic stellate cells；hepatic fibrosis

R289

A

1007－8517（2013）05－0022－03

2013.01.12）