■饶 瑞 桂庆平 郑宗林 Claire Yew Yoke Ching 刘鸿艳

(1.铜仁市渔政管理所，贵州铜仁 554300；2.西南大学水产动物繁育和健康养殖研究中心，重庆 402460；3.BEDSON S.A.,阿根廷；4.山东省滨州市海洋渔业局滨州海洋环境监测站，山东滨州 256600)

黄曲霉毒素B1(AFB)主要由黄曲霉菌产生，它将严重影响玉米、花生和其他作物的使用价值[1]。对AFB的研究发现，其除了具有很强的致癌作用外[2-3]，还能够抑制水产动物生长，并摧毁其免疫系统[4-5]。肝脏是对AFB敏感的器官，但不同种类的鱼对AFB的易感性千差万别，虹鳟（Oncorhynchus mykiss）对AFB非常敏感[6]，然而其他的鱼类，如斑点叉尾鮰（Ictalurus Punctaus），只有在高剂量时才受影响[6-8]。用含0.1 mg/kg AFB的日粮饲喂尼罗罗非鱼（Tilapia nilotica）10周，罗非鱼出现生长受阻，而且饲喂含0.2 mg/kg AFB的日粮已经有了16.7%的死亡率[9]。Nguyen研究发现，尼罗罗非鱼饲喂100 mg/kg的AFB日粮8周后出现死亡率上升和肝损伤现象[10]。

菜蓟提取物已被研究证明对肝脏功能有正面影响[11]，并能诱导胆汁分泌到肠道中，促进肠道对脂肪酸和脂溶性氨基酸的吸收[12-13]。菜蓟提取物还具有清除自由基等功效[14]。菜蓟提取复合物由菜蓟提取物与氯化胆碱等成分复方组合而成。但目前没有任何关于菜蓟提取复合物在水产养殖中作为生长促进剂或者保肝剂的报道。本试验拟通过多项指标评价菜蓟提取复合物对AFB攻毒的罗非鱼(Oreochromis niloticus)的生长以及肝脏保护机能的效果。

1 材料和方法

1.1 试验设计与日粮

试验分为3组，具体情况见表1，AFB纯品购于Westingarea(USA)。基础日粮或掺入了AFB和菜蓟提取复合物的日粮均在Hobart搅拌机中混合，然后在直径为2.4 mm的Hobart绞肉机上制粒，室温下风干，破碎成小块后4℃保存备用。基础日粮组成及营养水平见表2。饲喂试验持续8周。每次投喂后1 h收集未被摄食饲料，置105℃风干并称重。

表1 试验设计

表2 基础日粮组成及营养水平

1.2 试验鱼及养殖条件

试验前，罗非鱼投喂基础日粮暂养2周。然后将270尾体重接近的罗非鱼[(60.0±2.5)g]分成9组，分别置于蓄水体积200 L的玻璃缸中，循环流水并保持在1.5 L/min左右，溶氧控制在 4～6 mg/l，试验期间平均水温（25±1）℃。

1.3 样品采集和分析方法

1.3.1 生长性能检测

8周养殖试验结束后，禁食24 h，每组单独称重并采集试验需要的组织。每只缸随机抽取5尾鱼解剖，采集肝脏和其它内脏组织，用以计算肝体指数(HSI)和内脏指数(VSI)等，背部肌肉和肝脏样品密封在塑料袋中并冰冻保存（-18℃）备用。

增重率(PWG，%)=100×(末重-初重)/初重；

特定生长率(SGR，%/d)=100×ln(末重/初重)/试验天数；

饲料系数(FCR)=饲料消耗/体增重；

肝体指数(HSI)=100×肝脏重/总体重；

内脏指数(VSI)=100×内脏重/总体重；

肥满度(CF，g/cm3)=100×体重/(体长)3。

饲料、鱼肌肉样的粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分，以及肝脏脂肪含量参照AOAC（1995）的方法确定。

1.3.2 肝脏抗氧化活性测定

4℃条件下，肝脏样品经离心（600×g）后，取上清液用于各指标测定。

超氧化物歧化酶(SOD)活性参照Misra等的方法测定，略有改动[15]；过氧化氢酶(CAT)活性参照Aebi的方法测定[16]；丙二醛含量参照Mertens等的方法来测量。

1.3.3 血浆生化指标和病理学的测量

在8周饲喂试验后，从每缸中挑选5尾罗非鱼用MS-222麻醉，然后用1 ml无菌注射器尾静脉抽取1.5 ml血液，用肝素抗凝。血液在4℃条件下离心（700×g）30 min，再用HITACHI 7200型全自动生化分析仪检测血液生化指标；血液中酸性糖蛋白(AGP)采用美国Cardiotech公司的糖蛋白检测试剂盒测定；血细胞比容(Hct)用Agrawal等所描述的方法测定[17]。

每个鱼缸随机取3尾鱼，获取其肝脏做常规切片。

1.3.4 统计分析

所有的结果都以“平均值±标准差”表示。采用SPSS11.5对所有数据进行单因素方差分析，结果有显著差异时，进行Duncan's法多重比较。

2 结果

2.1 对生长性能的影响

8周养殖试验结束后，罗非鱼生长性能与不同处理间的日粮差异显著相关，见表3。饲料中含AFB后，罗非鱼的增重率、特定生长率、成活率比对照组显著降低（P＜0.05），成活率显著降低至50%，而饵料系数则显著提高1倍多（P＜0.05）；但在含AFB的饲料中补充了菜蓟提取复合物后，其增重率、特定生长率、成活率和饵料系数都得到明显改善，与对照组相比没有显著差异（P＞0.05）。

表3 菜蓟提取复合物对罗非鱼生长性能的影响(n=3；±SD)

表3 菜蓟提取复合物对罗非鱼生长性能的影响(n=3；±SD)

注：同行数据肩标字母不同表示显著差异(P＜0.05)；下表同。

项目增重率(%)特定生长率(%/d)饵料系数成活率(%)菜蓟补充组171.49±4.27a 1.73±0.13a 1.52±0.13a 89.48±5.24a对照组166.93±6.51a 1.70±0.11a 1.46±0.11a 91.36±5.41a黄曲霉毒素B1组53.74±5.47b 0.49±0.02b 3.57±0.02b 49.84±7.47b

2.2 对罗非鱼形体指标的影响

饲料中添加100 mg/kg AFB后，罗非鱼肥满度显著降低（P＜0.05），而肝体指数和内脏指数则显著升高（P＜0.05）。但在含AFB的饲料中补充了菜蓟提取复合物后，其肥满度、肝体指数和内脏指数得到明显改善，与对照组相比没有显著差异（P＞0.05），甚至肝体指数较对照组还有一定程度地降低（见表4）。

表4 菜蓟提取复合物对罗非鱼形体指标的影响(n=3；±SD)

表4 菜蓟提取复合物对罗非鱼形体指标的影响(n=3；±SD)

项目肥满度(g/cm3)肝体指数内脏指数对照组2.46±0.16a 1.90±0.14a 9.06±0.23a黄曲霉毒素B1组1.71±0.15b 2.61±0.14b 10.80±0.34b菜蓟补充组2.36±0.11a 1.78±0.13a 9.24±0.21a

2.3 对机体营养成分的影响

AFB的添加或在AFB的饲料中补充菜蓟提取复合物对罗非鱼肌肉粗脂肪和粗灰分含量无显著影响（P＞0.05），但AFB的添加导致罗非鱼肌肉水分和肝脏粗脂肪含量显著增加，肌肉粗蛋白含量的显著下降（P＜0.05），而在含AFB的饲料中补充了菜蓟提取复合物后，其肌肉水分、粗蛋白和肝脏粗脂肪含量与对照组相比无显著差异（P＞0.05），基本恢复正常（见表5）。

表5 菜蓟提取复合物对罗非鱼机体营养成分的影响(n=3；±SD)(%)

表5 菜蓟提取复合物对罗非鱼机体营养成分的影响(n=3；±SD)(%)

项目肌肉水分肌肉粗蛋白肌肉粗脂肪肌肉粗灰分肝脏粗脂肪对照组76.42±0.66a 18.70±0.13a 4.07±0.27a 1.22±0.13a 42.57±1.12a黄曲霉毒素B1组78.57±0.62b 16.97±0.21b 4.00±0.20a 1.18±0.03a 45.36±0.73b菜蓟补充组76.79±0.27a 18.32±0.25a 3.85±0.09a 1.18±0.07a 41.10±1.38a

2.4 对肝脏抗氧化机能的影响

试验以罗非鱼肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)生成量来判定其抗氧化性能(见表6)。从表6中可知，AFB的添加使罗非鱼的SOD和CAT活性及MDA生成量较对照组显著提高(P＜0.05)；补充菜蓟提取复合物后，MDA生成量较AFB组又显著降低（P＜0.05），但仍然显著高于对照组(P＜0.05)，而SOD和CAT活性则恢复至与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。

表6 菜蓟提取复合物对罗非鱼肝脏抗氧化机能的影响（n=3；±SD）

表6 菜蓟提取复合物对罗非鱼肝脏抗氧化机能的影响（n=3；±SD）

项目超氧化物歧化酶(U/mg)过氧化氢酶(U/mg)丙二醛(nmol/mg)对照组168.90±17.92a 0.22±0.03a 85.31±9.16a黄曲霉毒素B1组233.05±27.14b 0.41±0.07b 335.03±71.38b菜蓟补充组182.17±10.41a 0.19±0.03a 147.16±13.17c

2.5 对罗非鱼血浆生化指标的影响（见表7）

罗非鱼的红细胞比容(Hct)因AFB的添加而显著降低(P＜0.05)，而丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)活性和α-酸性糖蛋白(AGP)含量则显著提高(P＜0.05)；菜蓟提取复合物补充后，上述指标又恢复至与对照组无显著差异(P＞0.05)。唯一例外的是胆汁酸(BA)生成量，AFB的添加导致BA生成量显著减少(P＜0.05)，而补充菜蓟提取复合物后，BA生成量显著增加，并显著超过了对照组(P＜0.05)，可见菜蓟提取复合物对BA的生成有显著的影响。

表7 菜蓟提取复合物对罗非鱼血液生化指标的影响(n=3；±SD)

表7 菜蓟提取复合物对罗非鱼血液生化指标的影响(n=3；±SD)

项目红细胞比容(%)丙氨酸转氨酶(U/l)天门冬氨酸转氨酶(U/l)α-酸性糖蛋白(mg/l)胆汁酸(mmol/l)对照组39.47±5.41a 42.46±8.31a 189.15±17.00a 84.84±8.14a 64.92±4.40a黄曲霉毒素B1组14.05±3.41b 79.70±13.38b 377.66±15.01b 185.97±26.88b 45.30±2.26b菜蓟补充组31.38±7.41a 56.41±9.46a 224.63±28.18a 106.96±13.53a 80.43±3.13c

2.6 对肝细胞的影响

在正常的罗非鱼肝脏(见图1)中，肝细胞和细胞核大小及形状规则而均匀，肝脏中脂褐素较稀少。

图1 空白组罗非鱼肝脏（H&E,×200）

饲喂含AFB日粮的罗非鱼细胞质空泡化，出现明显的核偏位和严重的脂肪浸润（见图2）。

图2 饲喂含100 mg/kg AFB日粮的罗非鱼肝脏（H&E,×200）

然而，在含AFB的日粮中补充菜蓟提取复合物后，罗非鱼肝脏组织中形成大量的嗜碱性细胞包围着坏死的细胞，但并未形成明显结节。细胞空泡化、核偏位、脂质浸润等情况明显缓解(见图3)。

图3 饲喂含100 mg/kg AFB以及300 mg/kg菜蓟提取复合物日粮的罗非鱼肝脏（H&E,×200）

3 讨论

Cha'vez-Sa'nchez等(1994)用含30 mg/kg AFB的日粮饲喂罗非鱼25 d，发现死亡率和饲料中AFB的水平之间有直接联系[18]。本试验发现，饲喂含100 mg/kg的AFB日粮的罗非鱼8周，其死亡率明显增加，而与对照组相比，饲喂含AFB和菜蓟提取复合物为补充的日粮之后成活率差异不显著。由此可以推测饲料中一定含量的AFB对罗非鱼是有致死作用的，而菜蓟提取复合物能增强鱼体机能，以改善AFB等的负面影响，降低死亡率。

本研究发现，补充100 mg/kg AFB的日粮饲喂罗非鱼后，对其体增重和饵料系数等都有显著的副作用。Nguyen A.T(2002)报道，2.5 mg/kg AFB可显著降低罗非鱼的体增重[10]。Cha'vez-Sa'nchez等(1994)对奥尼罗非鱼的研究也发现相似情况，饲喂含1.88 mg/kg及以上含量的AFB导致增重下降，但直至30 mg/kg浓度的AFB仍然未对罗非鱼FCR有显著影响[18]。含2.15 mg/kg的AFB日粮饲喂斑点叉尾鮰10周导致其增重率下降24%[7]。本试验中发现，在含AFB的日粮中补充菜蓟提取复合物之后，罗非鱼的增重率及成活率与对照组相比没有显著差异。事实上，本研究发现，罗非鱼饲喂含AFB的日粮后常有回吐饲料的情况发生，但是补充菜蓟提取复合物后回吐饲料的情况大为减少。可能的原因是菜蓟提取复合物的补充可一定程度降低日粮中AFB对罗非鱼的毒性。

肝脏是鱼体内最易受AFB侵袭的器官[2]。本试验还对肝脏进行了病理观察，结果显示AFB致使罗非鱼细胞质空泡化，出现明显的核偏位和严重的脂肪浸润，而在AFB日粮中补充菜蓟提取复合物后，罗非鱼肝脏组织中形成大量嗜碱性细胞包围着坏死的细胞，但并未形成明显结节，由此推测这些嗜碱性细胞其实是新生的肝细胞，说明菜蓟提取复合物能刺激肝细胞的发生。

日粮中添加AFB和菜蓟提取复合物，都能对罗非鱼肝脏抗氧化酶活性及脂质过氧化物产生显著的影响。AFB的添加使肝脏过氧化物酶的活性显著提高，而菜蓟提取复合物的补充对肝脏有明显的保护作用。

血浆中ALT和AST的活性增加预示着肝(实质)细胞受到了破坏，酶液流出并进入了血液中[19]。血浆中ALT和AST活性已经被用于检测一些鱼类的肝脏受损情况[8,19-20]。本试验发现，AFB的添加导致了罗非鱼血浆中ALT和AST的活性显著升高，而在此基础上补充菜蓟提取复合物之后，血浆中ALT和AST的活性明显降低。

菜蓟提取物已经被证明能促使胆汁的产生及分泌入肠道中，从而影响脂肪酸和脂溶性氨基酸的吸收[12-13]。此外，它还能够清除自由基并且抑制某些粒细胞中的过氧化物酶的活性[14]。本试验中发现，AFB造成了罗非鱼的肝损伤，并导致胆汁分泌量减少，而菜蓟提取复合物的补充抵消了其部分负面作用，增强了肝脏胆汁的分泌，促进了营养物质的吸收和利用。Hct是一种测定红血细胞在全血中百分比的检测方法，这种检测方法与血细胞的数量和大小有关，AFB和菜蓟提取复合物对Hct的影响与对胆汁酸的分泌效果一致。

AGP是一种在动物肝脏中合成并在动物血液中发现的急相期蛋白，如AGP的水平在动物遭受疾病和应激的情况下升高，甚至动物未出现临床症状；如AGP在炎症和疾病的急性或慢性期变高。含AFB的日粮饲喂罗非鱼后诱发其血浆中AGP水平显著提高，AGP在肝脏中大量合成并进入血液，但是补充菜蓟提取复合物后，罗非鱼血浆中AGP水平恢复正常。切片结果也表明，菜蓟提取复合物有利于罗非鱼因AFB受损的肝脏新生。

综上可知，含一定剂量的黄曲霉毒素B1（AFB）的日粮对罗非鱼的生长会造成显著的负面影响，同时导致明显的肝损伤，而菜蓟提取复合物的补充能够减少罗非鱼的死亡，有效地保护其肝脏，并促进罗非鱼的生长。