赵 新， 王 永， 兰青阔， 陈 锐， 朱 珠， 余景会， 李欧静， 郭永泽

（天津市农业科学院 中心实验室，天津 300381）

据世界卫生组织估计，全世界每年有数以亿计的食源性疾病患者中，70%病源是各种致病性微生物。因而，建立一种准确快速的检测致病菌的方法一直是研究的热点[1-2]。国外针对致病微生物的快速检测，目前主要采用免疫学方法和显色培养基方法以及微生物自动鉴定系统[3-5]。上述方法的优点就是节省一定的鉴定时间，但缺点也非常明显，免疫学方法的缺点是操作技术性要求高，假阴性高，普及困难；显色培养基的缺点是不稳定，贮存时间短，受外界因素影响大；对于微生物自动鉴定系统，我国还未能生产完全自动化的细菌鉴定仪器设备，而且配套试剂也完全依赖进口。

随着生命科学的飞速发展，各种分子生物学实验技术不断涌现，并且以PCR技术为基础的分子生物学检验技术近年来已经广泛应用于微生物检测领域，但是这些技术仅能提供阳性扩增产物的片段大小信息，且无法显示特异性的基因序列，假阴性和假阳性无法避免，因此不足以提供确证结论。那么，焦磷酸测序 （Pyrosequencing）技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，从而能够真正达到快速、准确的鉴定病原微生物的目的，且操作极为简便[6]。

作者旨在利用焦磷酸测序技术建立同步检测和鉴定沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌等主要食源性致病菌的快速、简便、灵敏度高的方法，以期克服传统及其他快速致病微生物检测方法的诸多缺点，得到与国标方法一致的检测结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株

1）目标菌标准菌株:乙型副伤寒沙门氏菌CMCC （B）50094、 甲型副伤寒沙门氏菌CMCC（B）50433、鼠伤寒沙门氏菌 CMCC（B）50013；痢疾志贺氏菌 CMCC （B）51592、 福氏志贺氏菌 CMCC（B）51571、鲍氏志贺氏菌ATCC 9207；金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003；单增李斯特氏菌 CMCC（B）54002共8株常见的危害人和动物的沙门氏菌:作者所在实验室购买标准菌株。菌株复苏后接种于相应的增菌培养基中过夜培养。

2）非目标菌标准菌株:蜡样芽孢杆菌CMCC（B）63301，枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63501，大肠埃希氏菌 CMCC（B）44102，铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104，马红球菌ATCC 6939:作者所在实验室购买标准菌株。菌株复苏后接种于相应的增菌培养基中过夜培养。

1.1.2 主要试剂和仪器 特异性扩增引物和测序引物:上海生工合成；GoTaqRMaster Mix溶液:购自Promega 公 司 ；Sepharose Bead、binding buffer、Annealing Buffer、底物、酶和 A、C、G、T 四种碱基:购自Biotage公司；定量遗传分析仪:购自基因有限公司；PCR扩增仪:ABI Veriti及ABi 2720；凝胶电泳设备:BIO-RAD Power200；凝胶成像系统:SYNGENE公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 通过基因库数据检索网站 NCBI、VFDB、KEGG和 ClustalW 程序分别对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌毒力靶基因序列进行同源性分析，寻找各自适合的特异性序列[7-8]；再应用焦磷酸测序仪配套专业软件设计适合沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的焦磷酸测序特异性扩增和测序引物。

1.2.2 细菌DNA的提取 取选择性增菌后菌液100 μL，100 ℃煮菌 10 min， 立即-20 ℃冰浴 10 min，微型离心机离心2～3 min，上清液即为细菌DNA模板，备用。

1.2.3 PCR反应体系及扩增程序 扩增反应的总体积为 50 μL，其各种成分分别为:2×GoTaqRMaster Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，用灭菌去离子水补齐至50 μL；反应程序:94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸30 s，循环40次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.4 测序单链的制备将 3 μL链亲和素包被的磁珠和47 μL的binding buffer混匀，然后加入到50 μL的PCR产物中，1 300～1 400 r/min室温振荡混匀10～15 min；在PSQ Low反应板中预先加入40 μL含有 0.3 μmol/L 测序引物的 Annealing Buffer；在Vacuum prep workstation中进行单链制备，备用。

1.2.5 测序反应体系测序 反应的总体积约为150 μL， 其 中 各 种 成 分 分 别 为:PCR产 物 50 μL，Sepharose Beads 3 μL，Binding Buffer 47 μL （10 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1 g/dL Tween20，pH 7.6），10 μmol/L 测序引物 1.2 μL，Annealing Buffer 38.8 μL （20 mmol/L Tris-AC，2 mmol/L MgAC2，pH 7.6），再根据软件提示在试剂舱相对应位置加入所需的底物，酶和A、C、G、T。

1.2.6 测序反应程序 沙门氏菌CTTGACCCGGA AGCCTCCGC；单增李斯特氏菌ATTCACAACT TGG ATATCTG；金黄色葡萄球菌TTGATGATTGCCTA TCCCAAA；志贺氏菌AAACGGTCCAGTCGAAGTTC。

1.2.7 引物特异性试验 以目标菌的特异性引物和非目标菌的DNA模板构建PCR反应体系，进行PCR扩增及焦磷酸测序，以鉴定引物设计的特异性。

1.2.8 样品模板惟一性试验 以目标菌的特异性引物和含有目标菌同时也含有其他菌的DNA模板构建PCR反应体系，进行PCR扩增及焦磷酸测定，以证明对样品模板的质量要求。

1.2.9 添加灵敏度对比试验 将4种致病菌菌液分别进行 10 倍梯度稀释， 筛选出 105、104、103、102、10、1、0 CFU/mL的菌悬液，各取1 mL添加于24 mL无菌牛奶样本中备用。将上述一系列25 mL牛奶样本按照传统国标方法增菌，并进行后期生化鉴定[9-12]；同时将第一步的增菌液各取100 μL，用煮菌法提取模板DNA，用于PCR扩增而后进行焦磷酸测序。

1.2.10 方法验证 为了进一步验证本研究建立的食源性致病菌焦磷酸测序技术在实际检测中的可用性，应用本研究检测方法对包括鸡肉及制品、牛肉及制品、猪肉及制品、生鲜牛乳、蔬菜等共计284份日常实际样品进行了检测，并与国家标准方法的检验结果进行比较。沙门氏菌检验采用国家标准方法GB 4789.4-2010，单核细胞增生李斯特氏菌检验采用国家标准方法GB 4789.30-2010，金黄色葡萄球菌检验采用国家标准方法GB 4789.10-2010，志贺氏菌检验采用国家标准方法GB/T 4789.5-2003。

2 结果与讨论

2.1 引物设计结果

通过基因库数据检索网站NCBI BLAST，ClustalW程序和焦磷酸测序仪配套专业软件分别对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌进行焦磷酸测序特异性扩增引物和测序引物的设计，引物设计情况见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences in this study

2.2 PCR反应扩增结果

扩增反应的总体积为50 μL，其各种成分分别为:2×GoTaqRMaster Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各1 μL，模板DNA 2 μL，用灭菌去离子水补齐至50 μL；反应程序:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。取PCR产物5 μL用2 g/dL的琼脂糖凝胶电泳，均能得到扩增片段大小的条带，且空白对照均正常，结果见图1。

图1 4种食源性致病菌PCR扩增产物的电泳分析图谱Fig.1 PCR amplification result of four-kinds of foodborne pathogenic bacteria

2.3 焦磷酸测序结果

根据对4种食源性致病菌特异性序列的同源性比对，设计扩增引物和测序引物，通过基因库数据检索网站得到的4种食源性致病菌的已知待测序序列分别为:沙门氏菌CTTGACCCGG AAGCCTC CGC；金黄色葡萄球菌TTGATGATTG CCTATCCCA AA；志贺氏菌 AAACGGTCCA GTCGAAGTTC；单核细胞增生李斯特菌ATTCACAACT TGGATATCTG，经本实验方法焦磷酸测序后结果与已知待测序列吻合，结果见图 2～5。

图2 沙门氏菌扩增产物测序结果图Fig.2 Result of Salmonellla spp pyrosequencing

图3 金黄色葡萄球菌扩增产物测序结果图Fig.3 Result of Staphylococcus aureus pyrosequencing

图4 志贺氏菌扩增产物测序结果图Fig.4 Result of Shigella cereus pyrosequencing

图5 单核细胞增生李斯特菌扩增产物测序结果图Fig.5 Result of Listeria monocytogenes pyrosequencing

2.4 引物特异性试验结果

以4种食源性致病菌的特异性引物分别与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌的DNA模板以及其他非目标菌的混合DNA模板进行PCR扩增及焦磷酸测序，只有与特异性引物相吻合的DNA模板得到预期扩增片段大小及相应峰型，其余均未得到特异性条带及和已知序列吻合的峰型，由此鉴定了引物设计的特异性，结果见表2。

表2 引物特异性试验Table 2 Result of specific primers

2.5 样品模板惟一性试验

以沙门氏菌的特异性引物和含有沙门氏菌同时也含有其他菌的DNA模板构建PCR反应体系；以金黄色葡萄球菌的特异性引物和含有金黄色葡萄球菌同时也含有其他菌的DNA模板构建PCR反应体系（其他两种菌同理），进行PCR扩增及焦磷酸测定，均可得到相应目标菌的特异性条带及吻合峰型，由此证明只要样品模板中含有目标菌，就能扩增出特异性条带及吻合峰型，无需要求样品进行目标菌的纯培养，只要对样品进行一步目标菌选择性增菌，即可进行PCR扩增和焦磷酸测序，即使含有其他菌也不会影响试验结果，见表3。

2.6 添加灵敏度对比实验结果

4种食源性致病菌的传统国标方法鉴定结果为105、104、103、102、10 CFU/mL 的 添 加 样 品 均 检 出 ，1 CFU/mL和0 CFU/mL的添加样品未检出；焦磷酸测序 方 法 测 序 结 果 与 为 105、104、103、102、10 CFU/mL的添加样品均检出，1 CFU/mL和0 CFU/mL的添加样品未检出。由此可见，焦磷酸测序方法基于传统国标法的一步增菌，完全可达到相同的灵敏度，但省去了后期繁琐而费时的生化鉴定步骤，见图6～9。

表3 样品模板唯一性试验Table 3 Result of uniqueness of sample template

图6 沙门氏菌PCR扩增产物的电泳分析图谱Fig.6 PCR amplification result ofspecific primers in Salmonellla spp

图7 单核细胞增生李斯特菌PCR扩增产物的电泳分析图谱Fig.7 PCR amplification result of specific primers in Listeria monocytogenes

图8 金黄色葡萄球菌PCR扩增产物的电泳分析图谱Fig.8 PCR amplification result of specific primers in Staphylococcus aureus

图9 志贺氏菌PCR扩增产物的电泳分析图谱Fig.9 PCR amplification result of specific primers in Shigella cereus

2.7 方法验证结果

在所检测的284份日常实际检测样品中，沙门氏菌检验实际抽取样品127份，单核增生李斯特氏菌检验实际抽取样品87份，金黄色葡萄球菌检验实际抽取样品40份，志贺氏菌检验实际抽取样品30份，检测结果见表4。本研究建立的焦磷酸方法检出的4种食源性致病菌的阳性率与传统国标方法检测结果完全一致。

3 结语

近年来，人们对于食源性致病菌快速检测技术的研究已越来越深入，焦磷酸测序技术目前在国内、外领域还处于比较前沿和新型的技术手段时期，将该技术应用于食源性致病菌快速检测选择合适的毒力靶基因并设计出特异性扩增引物和测序引物对焦磷酸测序技术至关重要。通过4种食源性致病菌特异性保守序列同源性分析，结合焦磷酸实际应用要求，找到适合的特异性扩增片段区域100～200 bp，以及在此区域内4种食源性致病菌符合测序要求20 bp左右的变异区域或位点，利用专业软件得到特异性扩增引物和测序引物，并在扩增引物的上游或下游引物标记链亲和素包被的磁珠用于后期单链制备。

表4 焦磷酸测序方法验证Table 4 Method validation for Pyrosequencing method

单链制备在焦磷酸测序过程中也是关键步骤之一，且通过实际试验发现链亲和素包被的磁珠的充分吸附对试验结果影响明显，所以选用平底96孔板作为磁珠孵育及抓取底板，方法改进后效果明显。

作者建立的焦磷酸测序方法是将微生物检测基于分子水平的研究，且实现了在基因水平上对致病微生物进行最本质的序列分析及鉴定[13-14]。该方法通过对284份日常实际检测样品的验证不仅与传统国标方法检测结果一致，而且还具备准确、快速、操作简便和实时检测等优点，可以很好的杜绝假阳性及假阴性结果的产生，为食源性致病菌的快速鉴定开辟了广阔的前景[15-17]。

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