张诒亮 任玉琰

DNA生物传感器快速检测病原微生物的临床实验研究

张诒亮 任玉琰

目的 对DNA生物传感器在病原微生物的快速检测方面的临床实验效果进行分析探讨。方法 采用SPR传感器对甲型流感病毒进行微生物快速检测。结果 SPR传感器在与流感病毒的核酸进行杂交后, 能够灵敏、准确地将病毒的折射率反映出来, 且效率和敏感性都比较高。结论 DNA生物传感器相较于传统检测方法更具优势, 具有高通量、高敏感、高效率以及低成本等优点, 值得推广应用

DNA生物传感器；快速检测；病原微生物

分子生物检测法相较于传统的微生物检测方法,具有快速、敏感、成本低以及通量高等优点［1］, 因而在病原检测中得到了广泛应用, DNA生物传感器主要是通过探针将病原微生物中的DNA信息进行捕获后, 由换能器转换成信号来实现检测目的的一种亲和型传感器。本文主要对DNA生物传感器在病原微生物检测中的应用效果进行分析, 现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择甲型流感病毒作为检测对象,由本地的疾病控制预防中心提供。本次研究所使用的仪器主要有表面等离子体共振成像系统, GDS8000图像分析仪, 恒温水浴箱和干燥箱, 冷冻和微量离心机, PCR仪以及芯片杂交盒等；实验中所使用的试剂主要有金膜, 寡核苷酸引物, 6-巯基乙醇, bis-PNA探针, 病毒RNA抽提盒以及PCR试剂等。

1.2 试验方法 ①配制试剂, 对Piranha试剂、Tris-HCL缓冲液以及磷酸盐缓冲液等进行配制；②确定靶核酸, 在本次研究中将流感病毒的M基因片段选作靶核酸进行检测；③对探针和引物进行设计；④提取流感病毒核酸, 将140 μl病毒培养液加入到560 μl的AVL缓冲液中, 在孵育10 min之后加入560 μl乙醇进行搅拌。然后将混合液加入到离心机中进行离心处理, 反复两次后, 分别加入AW1和AW2缓冲液进行离心处理, 然后加入40 μl的AVE缓冲液进行离心处理, 这样收集到的滤液就是流感病毒的核酸溶液；⑤将流感病毒的核酸逆转录为cDNA, 并对其进行PCR扩增处理；⑥对探针进行还原和自组装处理；⑦杂交反应, 将病毒待检的双链DNA加入到磷酸盐缓冲液中, 然后将其滴加到金膜探针区, 放入杂交盒中进行杂交反应, 保持杂交盒的温度为37℃左右。

1.3 SPR检测 ①将杂交反应后的玻片取出冲洗干净后, 用SPR传感器对其SPR信号进行检测；②改变探针浓度, 并按照上面的方法进行固定后, 再次对病毒DNA的SPR信号进行检测；③继续按照上面的步骤改变探针浓度, 在完成探针固定后, 对与靶核酸杂交后的SPR信号进行检测；④对敏感性进行检测, 在待测芯片的表面用杂交围栏进行分割, 并取5 μmol/L浓度的探针进行点样固定, 在封闭金膜后, 对各个杂交区内的SPR信号进行检测；取杂交液与纯化核酸进行混合, 然后制成不同浓度与探针进行杂交, 对不同浓度的杂交金膜进行SPR信号检测, 并将其与单纯杂交液的结果进行对比。

2 结果

检测流感病毒的M基因片段扩增引物的片段大小是117 bp, 并对其进行检测, 结果显示这一大小符合检测设计要求, 特异性优良；改变探针浓度后, SPR信号的折射率会随着浓度的增加而增加, 在浓度超过5 μmol/L后增加幅度趋缓；改变探针浓度后,杂交物的SPR信号折射率也随着浓度的增加而增加,在超过5 μmol/L后折射率随着浓度增加而降低；在敏感性试验上, 1 pmol/L浓度以下的杂交液其SPR信号的折射率与纯杂交液的折射率之间差异无统计学意义, 差异较小。而在超过1 pmol/L浓度之后, 杂交液的折射率随着浓度的增加而增加, 且与纯杂交液之间的折射率差异也越来越大, 在5 pmol/L浓度之后差异有统计学意义, P<0.05。

3 讨论

DNA生物传感器是由探针和换能器两部分组成, 根据换能器信号转换的不同, 可将其分为光学传感器、压电传感器以及电化学传感器三种, 而根据标记物的选用与否又可以将其分为非标记型和标记型。标记型主要是通过信号分子对待测物的核酸进行标记, 然后与探针进行杂交使标记物被固定在传感器表面上, 这样通过检测信号分子的信号变化就能反映出待测物的信息。而非标记型则是将标记这一步骤省略, 直接用传感器对待测物进行检测, 通过其所引起的电化学或质量改变来反映待测物信息［2］。在本次研究中, 笔者主要选用了非标记型传感器中的典型代表SPR传感器, 对其在病原微生物检测中的应用进行了分析, 非标记型传感器的优点就在于其省略了用信号分子标记待测物这一步, 节省了繁琐的标记过程, 同时也避免了信号探针或分子对待测物与传感器之间杂交的影响, 节约了标记材料的费用, 缩短了检测时间, 提高了微生物检测效率［3］。

SPR对于折射率的变化非常灵敏, 通过成像技术, SPR传感器能够将微生物芯片的折射率变化呈现出来, 从而实现对微生物进行检测的目的。在本次研究中, 作者主要对甲型流感病毒的折射率分布进行了检测, 结果显示, SPS传感器能够灵敏地将病毒的M基因片段折射率在成像系统上的分布显示出来, 且分辨率较高, 能够得到检测物折射率与灰度值之间对应二维图像, 此方法的通量高、敏感性好, 测量范围广。在本次研究中, 实验室选用的探针为bis-PNA, 并对其进行了巯基修饰处理, 这样与金膜所组成的敏感膜对M基因片段扩增物进行检测, 而检测结果显示, 此探针能够与双链DNA进行直接结合,然后直接进行SPR检测能够将金膜的折射率信息快速地反映出来, 这说明这种探针设计在甲型流感病毒的检测中是可行的。同时, 在本次研究中, 笔者还对不同浓度探针下折射率的变化进行了分析, 结果表明, 随着浓度的增加, 金膜的折射率也随之增加,但在超过5 μmol/L浓度后, 这种增加趋势变缓, 这说明在5 μmol/L浓度以下的探针其对金膜折射率的反映更为敏感。同时, 笔者还对不同浓度探针下杂交后的金膜折射率进行了分析, 结果表明, 在5 μmol/L浓度之下, 随着浓度的增加, 金膜折射率也随之增加,且增加幅度较大。在超过5 μmol/L浓度探针之后,金膜的折射率随着浓度增加反而下降, 这说明在5 μmol/L浓度之下的探针对杂交后的金膜折射率更为敏感, 而在超过5 μmol/L之后, 其敏感性会下降。另外, 本次研究还对SPR在流感病毒检测上的敏感性进行了研究, 主要对不同浓度的靶序列在SPR检测上的敏感性进行了比较分析, 结果显示, 在1 pmol/L浓度之下, 靶序列折射率与纯杂交液的折射率之间差异无统计学意义, 而在超过1 pmol/L之后, 靶序列折射率随着浓度的增加而增加, 且在5 pmol/L浓度之后差异有统计学意义, P<0.05, 这说明本次检测的灵敏度为1 pmol/L。但本次由于时间原因, 仅仅对SPR传感器在流感病毒检测方面的应用进行了验证, 还需要对其进行进一步的临床应用和方法学评价, 且从本次研究的结果来看, SPR传感器检测在系统稳定性、检测方法以及检测探针等方面还有待改进提高。

综上所述, SPR传感器作为DNA传感器的一种,能够快速、灵敏地将待测物折射率分布情况进行反映, 且通量高、成像质量好, 值得在临床推广。这也说明DNA生物传感器与传统检测方法相比, 具有高通量、高效率等优点, 是未来病原微生物检测的主要检测手段, 因此研究人员应该加强对DNA传感器的研究, 发展传感器技术, 以不断提高微生物检测的效率和质量。

［1］蔡怡珊.基于电化学交流阻抗技术的DNA生物传感器对军团菌基因检测.理化检验(化学分册), 2012, 48(9):1090-1093.

［2］滕瑛巧.基于磁性高分子微球电化学DNA生物传感器用于水体中大肠杆菌的检测.分析化学, 2009, 37(02): 60-60.

［3］王云霞.电化学生物传感器在病原微生物快速检测中的研究进展.中华医院感染学杂志, 2012, 22(16):3677.

Experimental studtes on DNA biosensors for rapid detection of pathogenic microorganism

ZHANG Yi-liang, REN Yu-yan. Yantaishan Hospital, Yantai 264001, China

Objective To evaluate the clinical effect of DNA biosensor for rapid detection of pathogenic microorganisms.Methods Using the SPR sensor for rapid detection of microorganisms on influenza a virus.Results SPR sensor in nucleic acid hybridization with influenza virus, the virus can sensitively, accurately reflected the refractive index, and the efficiency and sensitivity were high.Conclusion The traditional method of detecting DNA biosensor compared with more advantages, the advantages of high throughput, high sensitive, high efficiency and low cost, and is worthy of popularization and application.

DNA biosensor; Rapid detection; Pathogenic microorganisms

R446

A

1674-9308(2013)03-0005-02

10.3969/J.ISSN.1674-9308.2013.03.003

264001 山东省烟台市烟台山医院