吴振兴，鲍蕾，赵华梅，静平，甘南琴

（1.山东出入境检验检疫局，山东青岛266000；2.中国科学院水生生物研究所，湖北武汉430072）

近年来淡水水体富营养化日益加剧，频繁暴发蓝藻水华。目前，世界上淡水湖泊蓝藻水华发生的频率与严重程度都呈现出迅猛的增长趋势。在我国，早在20世纪60年代太湖中就已经有蓝藻水华出现[1]。除了云南滇池、江苏太湖和安徽巢湖三大淡水湖泊已发生严重的蓝藻水华污染外[2-4]，长江、黄河中下游的许多湖泊和水库中也都相继发生了不同程度的蓝藻水华[5-7]。

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。流行病学调查表明，我国江苏省海门市、启东市和广西省扶绥县的原发肝癌发病率高与当地居民长期饮用含微量微囊藻毒素的浅塘水或河流水有关[8]。

微囊藻毒素是一类环状七肽化合物，目前发现有大约60 种异构体，在我国富营养化水体中常见的种类为MC-LR 和MC-RR，化学结构如图1 所示。其中MC-RR 最常见，而MC-LR 毒性最大。微囊藻毒素以肝脏为靶器官，能促使肿瘤细胞的生长，是迄今已发现的最强的肝癌促进剂，食用含有微囊藻毒素的淡水产品会引起肝脏损伤及肝炎等疾病。

高效液相色谱法（HPLC）是分析微囊藻毒素的常用方法[9]，但是其检测灵敏度较低，在淡水产品中微囊藻毒素的检测中不能满足相关的限量要求。同时由于淡水产品基质较为复杂，基质干扰会严重影响高效液相色谱分析的准确性[10]。固相萃取技术配合液相色谱-串联质谱，不仅可以有效去除基质干扰，而且具有更高的灵敏度和更强的定性、定量能力。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

超纯水。色谱级甲醇、乙腈、甲酸。MC-LR、MC-RR标准品，Alexis，纯度＞95 %。固相萃取小柱，Waters Sep-pakRClassic C18。玻璃纤维滤纸，Whatman GF/F规格。尼龙针头过滤器，0.22 μm。

1.2 仪器和设备

高效液相色谱仪（Agilent1200）；串联质谱仪（AB API 4000）；旋涡混匀仪（Thermolyne Maxi MixⅡ）；离心机（Sigma 2-5）；分析天平（Mettler Toledo PL403）；固相提取装置（Vicam）；氮吹仪（OrganomationN-EVAP111）。色谱柱（Merk LiChroCARTR125-2 RP-18e）。

1.3 方法

1.3.1 提取

准确称取5 g（精确至0.01 g）试样，置于50 mL 离心管中，加入15 mL 80%甲醇水溶液，充分振荡均匀，4 000 r/min 离心10 min，取上清液于新离心管中。残渣重复提取一次，合并两次提取液，以玻璃纤维滤纸过滤。取6 mL 滤液加入20 mL 水稀释。待净化。

1.3.2 净化

固相萃取小柱使用前依次用10 mL 甲醇和10 mL水活化，流速控制在1～2 滴/s，活化过程中保持萃取小柱始终充满液体。将提取液全部过柱后，以10 mL 20%甲醇水溶液对C18 固相萃取柱进行淋洗，淋洗液全部吹干，最后以10 mL 含有0.1%甲酸的甲醇洗脱微囊藻毒素。

1.3.3 定容

在40 ℃水浴下吹氮浓缩至近干。以25 %甲醇水溶液定容至1 mL，尼龙针头过滤器过滤后待上机检测。

1.3.4 液相色谱参考条件

流动相：A 液，水溶液（含有0.1%甲酸，5 mmol 甲酸铵）；B 液，95%乙腈水溶液（含有0.1%甲酸，5 mmol甲酸铵）。梯度洗脱条件如表1 所示。柱温：30 ℃。进样量：10 μL。

1.3.5 质谱参考条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）。扫描方式：正离子扫描。检测方式：多反应监测（MRM）。离子源电压：5 500。离子源温度：650 ℃。雾化气、气帘气、碰撞气、辅助加热气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition

多反应监测（MRM）参数如表2 所示。

表2 微囊藻毒素质谱检测多反应监测参数Table 2 MRM parameters for microcystins

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

根据MC-LR、MC-RR 的分子结构特征，选择电喷雾离子源（ESI）多反应监测（MRM）模式进行一级质谱分析，得到MC-LR、MC-RR 的分子离子峰，两种化合物都带有两个正电荷，离子质量与其所带电荷的比值即质荷比分别为498.4 和519.9。确定分子离子峰后再进行二级质谱碎片分析，得到特征子离子信息，根据其质谱图中的碎片离子选择丰度相对较高或相对分子量较大的碎片，最后确定特征子离子。MC-LR、MCRR 的二级质谱图如图1 所示。确定离子对后再对MRM 参数进行自动优化。

图1 MC-LR 和MC-RR 二级质谱图Fig.1 MS2 spectrum of MC-LR and MC-RR

确定MRM 参数以后，通过离子源的三通，同时以针泵向质谱注入微囊藻毒素标准品，并以液相向质谱注入流动相，进行离子源条件的优化，最终确定离子源参数。

2.2 液相条件的选择

2.2.1 流动相的选择

在流动相中加入甲酸，可以提高离子化效率，增加目标物的响应值；加入缓冲盐可以提高多目标物的分离，改善峰型，还具有去质子化的作用，进一步增加目标物的相应值。甲酸铵为挥发性缓冲盐，产生气相离子，不易堵塞管路和针，适用于质谱检测。

比较分析在流动相中加入不同浓度的甲酸和甲酸铵对目标物质谱响应和分离度的影响，甲酸设置两个浓度：0.1 %和0.5 %两个水平，甲酸铵设置3 个浓度：2、5、10 mmol/L 3 个水平。同样的质谱条件下检测1 μg/kg 含量的MC-LR、MC-RR，比较结果显示，甲酸浓度0.1%和0.5%两实验组没有明显差异；甲酸铵浓度5 mmol/L 实验组目标物的响应值最高，分离度满足要求。最终确认流动相中添加甲酸浓度为0.1%，甲酸铵浓度为5 mmol/L。

2.2.2 进样量和柱温的选择

在检测MC-LR、MC-RR 的时候增大进样量可以显著提高目标物的响应值，但是在检测样品的时候，进样量过大会导致峰型变差，峰宽过宽等情况，综合考虑响应值和实际检测中的基质影响，最终确定进样量为10 μL。柱温设定30 ℃，保持温度统一、恒定，以减少温度变化对仪器检测环节不确定度的影响。

2.2.3 前处理条件的选择

水产品中微囊藻毒素的提取方法已有相关报道[11-15]，本实验参考文献报道选择了不同浓度的甲醇溶液作提取溶液，经验证，80%的甲醇溶液具有更好的提取效率，完全可以满足微囊藻毒素-LR、-RR 的提取要求。为达到更高的提取效率，一般在样品提取过程中会采用长时间震荡等方式。但Smith[16]等的研究指出，在微囊藻毒素的加标回收试验中提取效率随着提取时间的延长而呈现下降趋势，主要原因是微囊藻毒素与样品中的蛋白磷酸酶或谷胱甘肽特异性地结合。基于这种原因，本实验尽量缩短样品提取时间，提高提取效率。

固相提取柱可以起到很好的富集、净化效果。在本研究的初始阶段，在以纯甲醇作为洗脱液的情况下发现MC-LR 回收率较好，而MC-RR 的回收率极低。在甲醇中添加0.1%浓度的甲酸后再次进行回收率实验，发现MC-RR 的回收率显著改善。分析原因可能为：MC-RR 有着比其他类型微囊藻毒素更高的疏水性，从而回收率较低；此外，在加入甲酸后，酸性环境促进了微囊藻毒素多肽质子化，同时甲酸减少了微囊藻毒素与硅胶表面硅醇基之间的相互作用，使其更容易被洗脱下来。

2.2.4 基质效应的消除

以质谱法检测水产品中的微囊藻毒素存在一定的基质效应，本实验通过减少基质成分和采用空白基质匹配标准校正法来尽可能地降低基质效应。基质效应的产生主要依赖于样品基质，因此，上机溶液中基质成分的含量是影响基质效应的重要因素之一，在样品净化过程中使用固相萃取柱，尽可能地减少提取液中的基质成分；在质谱检测环节中采用空白基质匹配标准校正法，空白样品经过前处理后，加入系列浓度待测物标准作为基质匹配标准溶液，用以对检测结果进行校正。

2.2.5 方法的线性关系和测定低限

在本测定方法所确定的实验条件下，分别以虾、鱼空白基质提取液配置系列标准溶液，基质标准品的质谱图如图2 所示。系列标准溶液浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/kg 以峰面积（Y 轴）对相应的微囊藻毒素各组分浓度（X 轴）作图。

图2 空白基质提取液配置标准品质谱图Fig.2 The mass spectrum of blank matrix standards

结果表明，2 种目标物的两个定量离子对都呈现良好的线性关系。线性关系如表3 所示。本方法的测定低限为1.0 μg/kg。

表3 线性关系Table 3 Linear relationship

2.2.6 方法的回收率和精密度

在0～10.0 μg/kg 的线性范围内，在空白虾、鱼基质样品中添加1.0、5.0、10.0 μg/kg 3 个浓度水平的MCLR 和MC-RR，每个水平做6 个平行样品，按照本研究建立的方法进行样品处理和检测，测得MC-LR 回收率范围为69.2%～95.6%，MC-RR 回收率范围为71.6 %～93.1%，变异系数为3.2%～7.3%。

[1] 顾岗.太湖蓝绿藻快速生长的原因及控制措施[J]. 上海环境科学,1996,15(12):10-11

[2] 沈建国.微囊藻毒素的污染、毒性和检测[J].预防医学情报杂志,2001,17(1):10-11

[3] 张维昊, 徐晓清, 丘昌强. 水环境中微囊藻毒素研究进展[J].环境科学研究,2001,14(2):57-61

[4] 邓义敏.滇池水体中微囊藻毒素的研究[J].云南环境科学,2000,19(增刊):117-119

[5] 董传辉,俞顺章,陈刚,等.江苏几个地区与某湖周围水厂不同类型水微囊藻毒素调查[J].环境与健康杂志,1998,15(3):111-113

[6] 孟玉珍,张丁,王兴国,等.郑州市水源水藻类和藻类毒素污染调查[J].卫生研究,1999,28(2):100-101

[7] 刘元波,陈伟明,范成新,等.太湖梅梁湾藻类生态模拟与蓝藻水华治理对策分析[J].湖泊科学,1998,10(4):53-60

[8] Yu S Z. Primary prevention of hepatocellular carcinoma[J].J Gastroenterol Hepatol,1995,10(6):674-682

[9] Lalita N S, Sarika S M, Tapan C. Methods for determining microcystins(peptide hepatotoxins)and microcystin-producing cyanobacteria[J].Water Res,2006,40(19):3485-3496

[10] Ikawa M,Phillips N,Haney J F,et al.Interference by plastics additives in HPLC determination of Microcystin-LR and-YR [J].Toxicon,1999,37(6):923-929

[11] Hu C L, Gan N Q, He Z K, et al. A novel chemiluminescent immunoassay for microcystin detection based on gold nanoparticles label and its application to MC analysis in aquatic environmental samples[J].Intern J Environ Anal Chem,2008,88(4):267-277

[12] Ruiz M J, Camean A M, Moreno I M, et al. Determination of microcystins in biological samples by matrix solid-phase dispersion and liquid chromatography-mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2005,1073(2005):257-262

[13] Dionisio Pires L M,Karlsson K M,M eriluoto J A O,et al.Assimilation and depuration of microcystin-LR by the zebra mussel, Dreissena polymorpha[J].Aquatic Toxicology,2004,69(4):385

[14] Rivasseau C, Hennion M C. Determination of some physiochemical parameters of microcystins and trace level analysis in environmental samples using liquid chromatography[J]. J Chromatography, 1998,799(1/2):155-169

[15] Cazenave J, W underlin D A, de Los Angeles Bistoni M, et al. Uptake, tissue distribution and accumulation of microcystin-RR in corydoras paleatus, Jenynsia multidentata and Odontesthes bonariensis. A field and laboratory study[J]. Aquat Toxicol, 2005, 75(2):178-190

[16] Smith J L, Boyer G L. Toxicity of microcystin-LR, a cyanobacterial toxin,to multiple life stages of the burrowing mayfly,Hexagenia,and possible implications for recruitment[J].Toxicon,2008,23(4):238