杨 耀 孙 翔 朱志军 张迎军

1.解放军第一一七医院心血管中心，浙江杭州 310000；2.内蒙古医科大学附属医院心内科，内蒙古呼和浩特 010058

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是对细胞外基质成分（extracellular matrix，EMC）有特异降解作用的锌依赖蛋白水解酶，在人体内主要作用是参与细胞外基质成分的降解、重构、炎性反应等各种生理及病理过程[1-3]。基质金属蛋白酶9（MMP-9）又称为明胶酶B，是基质金属蛋白酶家族之一，具有降解血管壁细胞外基质中成分的功能，影响动脉斑块的稳定性，与冠心病的发病具有一定关联性，目前已发现MMP-9基因中存在着多个序列变异，其中，启动子序列-1562C/T多态位点最受到关注。-1562C/T多态位点与冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary disease，CAD）易感性关系的研究结果众说纷纭[4]。为此，本研究通过采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应 （PCRRFLP），了解MMP-9-1562C/T基因多态性的分布，计算各SNP位点的等位基因频率、基因型频率，从而分析MMP-9-1562C/T基因多态性与CAD易感性的相关性，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用随机数字表法抽取2010年1月～2012年10月于解放军第一一七医院（以下简称“我院”）心内科就诊的冠心病患者240例作为病例组，其中，稳定型心绞痛（atable angina，SA）84 例，不稳定型心绞痛（unstable angina，UA）90例，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）66 例。病例的诊断及分型参照1997年WHO的诊断标准。同时随机抽取同期至我院其他科室就诊的患者200例作为对照组，患者冠状动脉造影结果均正常，未患有心脏相关疾病，无冠心病史。病例及对照组均排除患有恶性肿瘤、免疫系统疾病、感染性疾病、外周血管疾病、严重肝肾功能不全及使用免疫抑制剂者。两组平均年龄、性别构成等一般情况比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。所有入组调查对象间均无血缘关系，并且均签署知情同意书。所有实验操作规范及样本采集方式均经我院伦理委员会伦理会议通过。

表1 调查对象一般资料比较（ ±s）

表1 调查对象一般资料比较（ ±s）

注：1 mm Hg=0.133 kPa；BMI：体重指数；SBP：收缩压；DBP：舒张压；Glu：血糖；TG：三酰甘油；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDLC：低密度脂蛋白胆固醇

病例组对照组t/χ2值P值61.6±11.7 61.9±10.6 1.285＞0.05 159/81 126/74 1.006＞0.05 24.0±3.0 23.1±2.5 1.320＞0.05 129.7±15.3 127.6±14.4 0.745＞0.05 80.9±11.7 78.5±8.8 0.584＞0.05 4.9±1.4 4.9±1.3 0.412＞0.05 1.7±0.6 1.6±0.6 0.303＞0.05组别 年龄（岁）性别（例，男/女）BMI（kg/m2）SBP（mm Hg）DBP（mm Hg）Glu（mmol/L）TG（mmol/L）4.7±1.7 4.7±1.2 0.314＞0.05 1.0±0.2 1.0±0.3 0.257＞0.05 3.1±1.1 3.2±0.4 0.679＞0.05 TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 SphⅠ限制性内切酶由伊普瑞斯科技有限公司提供，紫外分光光度计、PCR仪由上海医科大学仪器厂提供。

1.2.2 资料收集及常规检测 收集病例组及对照组的一般人口学特征（年龄、性别）、家族史、冠心病史、冠心病危险因素暴露情况（高血压、糖尿病、高脂血症等），对调查对象进行血压、血糖、血脂等常规检测。

1.2.3 PCR检测 采用PCR-RFLR法对调查对象血液样本进行基因分型，并对比病例组及对照组之间的差异。人类MMP-9 基因（ID：4318）位于 20q11.2～q13.1，长 7654 bp，mRNA长2387 bp，编码 13个外显子，该基因共 155个单核苷酸多态性 （SNPs），本次研究选择位于启动子区的-1562C/T作为研究位点。采用盐析法提取调查对象外周血基因组DNA，对提取的DNA进行鉴定，若DNA的OD260/OD280＞1.7，说明DNA纯度合格，否则需从新提取。将鉴定合格的DNA进行定量，根据测定原液的DNA浓度加入TE液，将DNA的终浓度稀释为20 ng/μL。建立PCR反应体系 10 μL及酶切体系15 μL，PCR的反应条件如下：95°C 5 min；95°C 30 s，69°C 30 s，72°C 40 s，35 个循环；72°C 7 min， 产物为 435 bp。 引物序列为 （U）5'-CCTGCTA CAATATACCCCC-3'， （L）5'-CTTCTCTAGCCTCAGGGCATC-3'。内切酶酶切片段长度C等位基因为435 bp，T等位基因为247 bp+188 bp。当-1562C/T多态性为C等位基因时，PCR产物不能被SphⅠ内切酶识别，反应后MMP-9-1562C/T为CC纯合子基因型的个体片段长度为仅一个片段，为435 bp；MMP-9-1562C/T多态性为T等位基因时，PCR产物可被SphⅠ识别，因此，MMP-9-1562C/T为TT纯合子基因型个体经限制性内切酶SphⅠ酶切后产生两个片段，分别为247 bp和188 bp；MMP-9-1562C/T为CT杂合子基因型个体的PCR产物经SphⅠ酶切后产生3个片段，分别为435 bp、247 bp和188 bp。采用琼脂糖凝胶电泳法鉴定样本的基因型，凝胶成像结果胶片拍照保存并由两名医师独立判断结果，核实后录入数据库。

1.3 统计学方法

采用SPSS 14.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

病例组 MMP-9-1562C/T基因型为 CC、CT、TT的频率分别为 0.78、0.20、0.02， 对照组分别为 0.81、0.18、0.01，两组基因型的分布差异无统计学意义（χ2=0.59，P＞0.05）；病例组与对照组CC/CT+TT的OR值为0.83，差异无统计学意义（OR 95%CI：0.51～1.36，P>0.05），见表 2。 病例组与对照组C/T等位基因OR值为0.83，差异也无统计学意义（OR 95%CI：0.44～1.55，P ＞ 0.05），见表 3。 提示 MMP-9-1562C/T基因型及等位基因与冠心病的发生无关联性。

表2 两组MMP-9-1562C/T基因型频率情况

表3 两组MMP-9-1562C/T等位基因频率情况

3 讨论

目前越来越多的研究证实MMPs启动子区域的SNPs影响着MMPs的转录活动，MMPs活性增强时[5-7]，会引起动脉中胶原成分的减少，使冠状动脉中斑块结构脆化，纤维帽易于破裂，从而引起冠心病的发生。MMP-9是MMPs中重要的一员，能够广泛降解明胶、胶原及弹性蛋白。有动物实验建立了敲除MMP-9基因的小鼠模型[8]，结果发现，敲除模型小鼠比野生小鼠更不容易发生动脉粥样硬化病变。因此，认为高度表达的MMP-9基因与冠脉粥样硬化、冠状动脉斑块不稳定、支架内再狭窄等有关。人类MMP-9基因（ID：4318）位于 20q11.2～q13.1，共 155 个 SNPs，其中，位于启动子区的-1562C/T与冠心病发生的关联性较受关注。既往研究认为，-1562C/T多态性位点的碱基突变能够在转录水平影响基因表达，从而影响酶蛋白合成数量。当突变位点位于该基因与转录抑制蛋白结合的区域内，C碱基突变为T碱基后，区域的构型即可发生变化，导致基因与转录抑制蛋白的结合力下降，转录抑制的作用减弱，启动子活性增强，基因转录增强，MMP-9表达量增加，MMP-9对细胞外基质的降解增加，导致冠状动脉破坏增加。

然而，目前关于MMP-9-1562C/T与冠心病发生关联性的报道结论不一致[9-12]。有文献证实了，-1562C＞T基因多态性与冠状动脉狭窄程度具有相关性，冠心病患者中CT和TT两种基因型的分布频率明显高于冠状动脉造影正常者；经过Logistic回归分析后发现，T等位基因携带者发生冠心病的风险比未携带该等位基因者高1.5倍[9-10]。而Wang等[11]报道，-1562C/T多态性与冠状动脉粥样硬化程度无关。Haberbosch等[12]通过设计病例对照研究在德国人群中研究的结果认为，MMP-9基因-1562C＞T多态性与冠心病的发病及心肌梗死的发生无相关。本次研究结果也显示，MMP-有1只于术后第9天死于肺炎。Fandrich等[7]也发现，有2只实验动物因分泌的黏液积聚在移植物的远端而致肺水肿和肺不张。而Letang等[5]应用纱布擦去小肠的黏膜层后未发现大量黏液分泌的现象。本实验结果也支持该结果。A组（不去空肠黏膜组）发现气管造瘘口术后 1周内有较多肠液流出，有2只Beagle犬在术后第2周因肺部感染死亡，而B、C组（部分及全部去空肠黏膜组）术后1周内则有较少肠液流出，咳嗽较轻。然而，过度搔刮全部去除黏膜层，亦会造成术后肉芽生长，上皮生长延迟，因缺乏上皮的覆盖，会减弱动物抵抗病原体感染的能力。本实验中全部去除黏膜层组有1只Beagle犬在术后第50天因移植空肠感染而死亡，估计与上述因素有关。

化生是机体的一种组织因细胞生活环境改变或理化因素刺激，在形态和机能上变为另一种组织的过程，是机体的一种适应现象。正常气管的内壁为假复层纤毛柱状上皮覆盖，黏液-纤毛转用系统在气道防御机制中占有重要地位，是气道的第一道防线。而空肠内腔为单层柱状上皮，有大量小肠腺和绒毛结构，不存在黏液-纤毛转用系统。因此，移植空肠的黏膜上皮完全化生为假复层纤毛柱状上皮，并具有正常的纤毛功能，这是最为理想的气管重建。Letang等[5]擦除了空肠黏膜行肠代气管重建的实验中发现，术后在吻合口附近的空肠腔内有少量的鳞状上皮出现，术后3周有近20%的空肠表面被鳞状上皮覆盖，认为这些鳞状上皮可能起源于附近的正常气管的上皮。Nakayama[6]的研究也观察到类似的现象。本研究在空肠重建气管缺损动物模型的肠膜黏组织变化的研究过程中，也观察到了这一现象：A、B、C三组均在术后6个月，在移植空肠表面见假复层纤毛柱状上皮覆盖，B、C组较A组 早1个月出现假复层纤毛柱状上皮。以上实验结果表明，去部分空肠黏膜能加速移植空肠的上皮化，加速纤毛柱状上皮的化生，但对空肠黏膜的最终化生结果没有影响。

本组实验结果显示，去除部分肠黏膜能有效减少分泌细胞的数量，从而减少移植空肠的肠液分泌，减少分泌物对呼吸系统的影响；去部分肠黏膜能加速空肠黏膜萎缩变薄、绒毛变短脱落[8-9]，促进鳞状上皮化生，减少因缺乏上皮的覆盖，导致病原体的感染，从而促进气管愈合。据此，去部分肠黏膜游离空肠重建气管动物模型是一较为理想的游离空肠重建气管动物模型，其将有望解决空肠移植术后腺体分泌及上皮覆盖这两大难题，使游离空肠重建气管技术更接近理想，为游离空肠重建气管应用于临床提供良好的实验依据。

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