彭新 关兵 徐英 徐丽 李霞 张俊中 于爱民

·调查研究·

扬州市278例非综合征性耳聋患者常见耳聋基因突变检测结果分析△

彭新 关兵 徐英 徐丽 李霞 张俊中 于爱民

目的调查扬州地区非综合征性耳聋（NSHI）患者分子流行病学特征，了解耳聋的分子病因。方法所选对象为江苏省扬州市中、重度NSHI患者，共278例。利用耳聋基因芯片诊断试剂盒和直接测序2种方法筛查4个国人中常见的耳聋相关基因中的9个热点突变，包括GJB2（35delG、176del16、235delC、299del AT），GJB3（538C＞T），SLC26A4（IVS7-2A＞G、2168A＞G）和线粒体DNA 12S rRNA（A1555G及1494C＞T）突变。结果在278例耳聋患者中，2种方法共检出145例携带致聋突变（突变比率达到52.2％）。GJB2突变患者人数88例，其中纯合突变51例（18.3％）、单杂合突变25例（9.0％）、复合杂合突变12例（4.3％）。SLC26A4纯合突变14例（5.0％）、单杂合突变26例（9.4％）、复合杂合13例（4.7％）。235delC纯合突变/SLC26A4 IVS7-2A＞G杂合突变1例（0.4％），235delC纯合突变/SLC26A4 IVS7-2A＞G杂合突变1例（0.4％），线粒体DNA12SrRNA A1555G突变2例（0.7％）；阴性133例（47.8％）。结论扬州地区耳聋患者GJB2突变高于全国的遗传性耳聋平均发生率。应用耳聋基因诊断技术可以在耳聋患者病因调查中进行快速诊断筛查，值得推广应用。（中国眼耳鼻喉科杂志，2013，13：254-257）

耳聋基因； GJB2； SLC26A4； 线粒体突变； 非综合征性耳聋

在我国每年患各种出生缺陷和先天残疾的80万～120万名新生儿中，听力残疾是最常见的，也是最严重的。2006年第2次全国残疾人抽样调查结果显示，我国有听力障碍患者多达2 780万人，占全国8 296万残疾人的33.5％，列各类残疾之首；造成听力障碍的原因是多方面的，大致可以分为遗传因素和环境因素两大类，遗传性耳聋约占50％；资料还显示，在新生儿中，听力损害的发生率0.05％，67.7％为遗传缺陷所致［1］。世界第1个被克隆和鉴定遗传性耳聋基因缝隙连接蛋白（gap junctionβ2，GJB2）由于其突变频率的高发性，一直为研究热点。在国内，最常见的突变是235del C；大前庭导水管综合征（large vestibular aqueduct syndrome，LVAS）相关基因SLC26A4为国人次要致病基因［2］。此外，氨基糖苷类药物是线粒体A1555G突变的携带者高危因素。本课题对扬州市278例患者进行了GJB2、SLC26A4、线粒体DNA12S rRNA（1555A＞G）和GJB3突变筛查。

1 资料与方法

1.1 研究对象 特殊教育学校及门诊患者共计307例受检人群，通过介绍聋病基因筛查的意义及目的，让受试者有初步了解，然后当场发放“耳聋疾病调查问卷”。调查表内容包括：目标人群基本信息、耳聋史、家族史、耳聋前传染病、耳毒性药物应用史、头部外伤史等。并有专门培训医师填写“耳聋疾病病史模板”。同时填写知情同意书（未满18周岁者由家长或监护人签署）。入选标准：耳聋患者全部接受纯音测听和声导抗检查，检查后发现278例患者为中、重度耳聋，极重度耳聋；其中聋校学生149例、门诊患者129例；年龄4个月～56岁；男性142例、女性136例。排除标准：与国外种族联姻家族史者；外耳、中耳畸形者；伴全身疾病者；智力障碍者；综合征性耳聋（SHI）患者。经问卷调查及体格检查全部患者为非综合征性耳聋（nonsyndromic hearing impairment，NSHI）。

1.2 DNA提取方法 用含枸橼酸钠抗凝剂（EDTA）的真空采血管采集受检者3～5 mL外周静脉血，应用DNA试剂盒（QIAGEN公司），用BECKMAN DU800紫外分光光度计进行定量和纯度检测。取部分基因组DNA稀释至200 ng/μL，剩余置-80℃保存。

1.3 基因芯片检测 测试4个国人中常见的耳聋相关基因中的9个热点突变，包括GJB2（35delG、176del16、235delC、299delAT），GJB3（538C＞T），SLC26A4（IVS7-2A＞G、2168A＞G）和线粒体DNA 12S rRNA（A1555G，1494 C＞T）。

检测原理：针对不同突变位点设计2个带不同标签的上游探针和1个下游带Cv3荧光标记的公共引物。先在液相中进行多重等位基因特异性引物延伸聚合酶链反应（PCR），其扩增产物在带上一段标签序列（tag sequence）的同时，被单色荧光所标记。将产物变性后，与固定有标签互补寡核苷酸序列的芯片杂交。通过激光扫描检测出突变位点［3］。

检测仪器及试剂：PCR仪（E-CY-CLER 96，北京博奥生物）、恒温水浴箱、HZQ-C空气浴振荡器、荧光标记引物以及晶芯微阵列芯片扫描仪及相应软件系统、质控探针和DNA芯片、杂交盒及杂交试剂。

1.4 直接测序方法 参照文献［4］报道的实验方法，采用直接测序的方法检测GJB2、SLC26A4 IVS7-2 A＞G 2168A＞G 2个位点和线粒体DNA 12S rRNA突变。用测序方法随机验证芯片方法所检测出阳性样本，发现符合率达100％。

2 结果

2.1 GJB2突变检测结果 在本次调查的278例受试者中，用2种检测方法发现携带GJB2致病突变总计88例，突变率31.7％（88/278），包括235delC纯合突变44例（15.8％）、235delC单杂合突变17例（6.1％）、235delC和299delAT复合杂合突变9例（3.2％）、299delAT纯合突变5例（1.8％）、299delAT单杂合突变3例（1.1％）。176del16纯合突变2例（0.7％）、176del16杂合突变5例（1.8％）、176del16/235delC复合杂合突变3例（1.1％）。

2.2 SLC26A4突变检测结果 在本次调查中，只检测SLC26A4突变中最常见的2种突变位点，即SLC26A4 IVS7-2A＞G和2168A＞G，其中SLC26A4 IVS7-2A＞G纯合突变9例（3.2％）、SLC26A4 IVS7-2A＞G杂合突变18例（6.5％）、SLC26A4 2168A＞G纯合突变5例（1.8％）、SLC26A4 2168A＞G杂合突变8例（2.9％）、IVS7-2A＞G和2168A＞G复合杂合突变13例（4.7％）。对其中的确诊患者行颞骨高分辨率CT检查证实为LVAS。

2.3 线粒体DNA12SrRNA A1555G突变 278例样本中有2例A1555G突变阳性，占0.7％。

2.4 多个基因突变患者 实验结果中发现1个有多个基因突变患者家庭，总共4个检测对象。其中母亲突变类型为235delC纯合突变、父亲突变类型为235delC杂合突变/SLC26A4 IVS7-2A＞G；第1胎为先证者，突变类型为235delC纯合突变，第2胎突变类型为235delC杂合突变SLC26A4 IVS7-2A＞G杂合突变。对其家庭其余3个成员听力检测为中、重度耳聋，家庭4个成员进行颞骨CT检查，均未发现前庭导水管异常。

未检测出GJB3、1494 C＞T突变患者。

3 讨论

耳聋是一种临床常见病，新生儿耳聋的发病率为0.1％，出生时或3岁前出现听力丧失称为语前聋。造成耳聋的原因很多，50％以上儿童期耳聋为遗传性聋，发病率为1/800～1/1 000［5］。这类患者除耳聋外不伴其他症状，称为NSHI。目前有400多种综合征性疾病伴耳聋或听力减退，但是80％患者多为NSHI［6］，由于耳聋具有很强的遗传异质性和表型模糊，使得耳聋的遗传机制比较复杂。在临床上，由于感音性聋治疗目前尚无有效办法，只有从分子诊断水平做出分析，提早进行干预，才能有效降低发病率。下面就常见突变位点进行阐述。

GJB2（Cx26）是组成缝隙连接蛋白家族的一员，定位在13q11-q12，编码连接蛋白26，有2个外显子，是相邻细胞间的特殊通道，第二信使和代谢小分子物质的重要通道，在信息传递和物质交换中起着重要的作用。Kikuchi等［7］利用免疫组织化学技术发现GJB2基因在哺乳动物耳蜗高表达，并认为缝隙连接在毛细胞受到外界刺激后钾离子回流到内淋巴的过程中有重要作用。它可以引起NSHI和SHI。目前发现有220多个突变位点，且在SHI患者中比例为10％～50％［1，8］。有文献［9-10］报道，在日本235delC是主要突变形式，在所有GJB2突变中的比例高达73％。流行病学显示，在中国及日本，GJB2最常见的4个突变位点为：235delC、35delG、176del16及299delAT；占GJB2突变的80％。Dai等［11-12］对中国18个省份聋校的1 680例NSHI病例GJB2基因235delC突变的筛查中，发现该突变检出率为18.16％，陶峥等［13］的研究结果显示，上海及周边地区235delC为热点突变。我们的实验检测出GJB2突变31.7％（88/278），其中检查出双等位基因总突变率患者占23.4％（65/278），均高于目前报道平均水平。产生原因可能是：①扬州及周边地区GJB2致病率较高；②与检测策略有关。我们发现，检测完致病突变患者后，对大多数患者直系家属进行检测，导致检出率较高。GJB2导致的耳聋多数为是语前聋，呈非进行性，为重度及极重度。研究表明，大多数患者听神经是正常的，这些患者可以借助人工耳蜗植入的方法重建部分听力，可以取得较好的听力改善。所以，当确诊为GJB2突变患者，要把更多精力放在早期听力干预和基因筛查从而进行产前诊断，评估风险系数预测，指导患者家族内成员的婚育，避免再次生育出此类遗传性耳聋患儿。因此，实验结果提示，在接下来的预防措施中，应当结合本地区的特点，以降低GJB2致聋率为主要工作任务。

LVAS属于常染色体隐性遗传病，先证者的父母为无临床症状的突变携带者，患者常携带双等位基因突变。且患者中有男性也有女性。在儿童和青少年感音神经性聋中占1％～12％［14-15］。国外多项研究证实，SLC26A4基因突变与Pendred综合征（前庭导水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿）和单纯前庭导水管扩大和（或）内耳畸形有密切关系，但是热点突变存在着明显的地域和种族差异。左路杰等［16］报道，SLC26A4基因突变位点超过150多个，其中大多数为错义突变。在我国，袁永一等［4］在国内外首次对大规模重度、极重度耳聋人群进行了基于SLC26A4基因热点突变的该基因全序列分析，2 352例来自全国多个地区的耳聋患者中271例携带SLC26A4基因ⅣS7-2A＞G突变，ⅣS7-2A＞G突变总检出率达到11.52％（27l/2 352）。通过基因筛查初步了解扬州地区SLC26A4基因相关前庭导水管扩大的发病情况超过10％。本文通过对扬州地区筛查发现，SLC26A4基因最常见的突变方式是IVS7-2A＞G。SLC26A4携带双等位基因突变患者达到9.7％（27/278），这与中国LVAS耳聋人群的文献报道基本相符合。我们对双等位基因突变患者进行颞骨高分辨率CT扫描发现，均证实为LVAS患者。同样对剩余单杂合突变患者经行CT发现4例为LVAS患者，出现其原因为存在另外一个少见外显子突变。需要进一步实验证实。

氨基糖苷类药物诱发的耳聋具有一些共同特征，即双侧对称性以高频听力下降为主的感音神经性聋，患者通常有明确的氨基糖苷类药物应用史。目前大量研究已证实mtDNA突变与此类耳聋密切相关，部分患者对氨基糖苷类药物有易感性，即极小的量就可以造成听力损失。mtDNA 12S rRNA是突变热点，本实验中发现突变位点以第1555位A＞G均质性点突变。且在本实验病史采集中发现，19位患者提供明确药物耳毒性药物使用史，但检查结果只发现2例携带该突变，未检测出1494 C＞T突变。考虑原因主要为由于耳毒性药物使用较广泛，患者简单认为耳聋和使用药物相关。对于检测处该突变的患者家族，最直接、有效的办法是终身禁用耳毒性药物。

综上所述，通过对278例患者进行检测，发现扬州地区GJB2致聋高于国内其他报道水平，对于大多数患者可以从分子学进行诊断，能够体现出扬州及周边地区遗传性耳聋流行病学自身特点，从而为降低发病率、优生优育提供理论基础。基因芯片能够快速对常见突变进行诊断，值得在基层医院推广。直接测序技术能够对整条基因进行测序工作。两者联合检测，能够提供更多遗传信息。

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（本文编辑 杨美琴）

·学术动态·

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院“全国白内障、眼表疾病高级研修班和名医论坛”通知

兹定于2013年11月7～10日在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院举办“全国白内障、眼表疾病高级研修班和名医论坛”，包含两项继续教育项目（项目代码20130702052，Ⅰ类学分10分；项目代码20130702204，Ⅰ类学分10分）。学习期满并合格者将授予国家级继续教育Ⅰ类学分。

“晶状体疾病的诊治及进展”高级研修班和名医论坛：由国内著名专家卢奕教授、罗怡教授及特邀的国内外其他知名专家等担任主讲和手术示范。授课内容包括白内障手术现状、挑战及IOL概论（包括各种高端IOL的应用）、白内障手术前后的辅助检查、角膜屈光手术后IOL测量（RK、PRK、LASIK和LASEK术后IOL的计算）、个性化IOL的选择、白内障手术散光的控制、微创白内障手术、复杂白内障的超乳手术分享及病例讨论、晶状体脱位的处理、虹膜缺损时白内障手术、先天性白内障诊断和治疗、二期IOL植入、眼内炎的预防和治疗、IOL脱位处理等。复旦大学附属眼耳鼻喉科医院是卫生部和上海市眼科住院医师培训基地，并拥有专门的白内障手术模拟训练室，拥有8台Infiniti超乳设备、8台Leica显微镜手术操作系统和8个工作台以及多媒体教学系统，让学员体验真实的动物实验超声乳化感觉。

“眼表疾病诊治及进展”学习班：由国内著名专家徐建江教授、张朝然教授和龚岚教授等担任主讲。授课内容包括：①各类常见眼表疾病，诸如感染性角膜病变、免疫性角膜病变、干眼、角膜营养不良以及过敏性结膜炎等的传统治疗及诊疗进展；②主要眼表手术及进展，除对穿透性角膜移植、板层角膜移植等常规手术进行讲解，还将重点对近年来国际上出现的深部前板层和后弹力层撕除的角膜内皮移植等新型手术方式进行演示和讲解；③新型眼前节检查设备在眼表疾病诊治中的应用，主要包括角膜共聚焦显微镜和眼前节OCT的应用和结果分析；④疑难和典型病例分享，通过实际病例分析，进一步加深学员对眼表疾病知识的掌握。

本次学习班学费1000元，资料费150元（含1本讲义和1张光盘）。联系人：陆萍，电话：021-64377134-706；021-64318258。更详细的内容及报名回执表可从复旦大学附属眼耳鼻喉科医院网站（http：//www.fdeent.org/）下载。竭诚欢迎广大眼科医师前来学习交流。

陆萍

Mutation of gene in nonsyndrom ic hearing impairment patients：analysis of 278 cases in Yangzhou area

PENG Xin，GUAN Bing，XU Ying，XU Li，LIXia，ZHANG Jun-zhong，YU Ai-min.Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Clinical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001，China

GUAN Bing，Email：aliceguan0685＠sina.com

Objective To survey themolecular epidemiological basis of non-syndromic hearing loss in Yangzhou area.Methods Two hundred and seventy-eight patients with severe non-syndromic deafness in Yangzhou city were included in the study.Deafness gene chip diagnostic kit for screening and direct sequencing were used for screening the nine hot spotsmutations in four common deafness-related genes of Chinese people.These nine hot spots genemutations included GJB2（35delG，176del16，235delC and 299del AT），GJB3（538C＞T），SLC26A4（IVS7-2A＞G，2168A＞G）and mtDNA 12S rRNA（A1555G，1494C＞T）.Results In 278 patients，there were 145 cases of deafness caused by mutation（carrying themutation ratio reached 52.2％）.The GJB2mutationswere found in 88 cases，including51 cases of homozygousmutations（18.3％），25 cases（9％）of single heterozygousmutations，and 12 patients（4.3％）of compound heterozygousmutations.SLC26A4 homozygous mutations were found in 14 cases（5％），including single heterozygousmutations in 26 cases（9.4％），compound heterozygosity in 13 cases（4.7％）.235delC homozygous mutation/SLC26A4 IVS7-2A＞G heterozygous mutation was found in 1 case（0.4％），DNA12SrRNA mitochondrial A1555Gmutation was found in 2 patients（0.7％）.And 133 cases（47.8％）showed negative.Conclusions The deaf patients in Yangzhou were found to have a higher incidence of genetic deafness in GJB2.It was worth applying the deafness gene diagnostic techniques into rapid diagnostic screening of the cause of deafness.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：254-257）

Deafness gene；GJB2 gene；SLC26A4 gene；mitochondrialmutations；non-syndromic deafness

2012-09-26）

扬州市社会发展项目（YZ2009047）；江苏省科技支撑计划（SBE201270809）

扬州大学临床医学院耳鼻咽喉头颈外科 扬州 225001

关兵（Email：aliceguan0685＠sina.com）