韩丽丽 刘存志 石广霞

·综 述·

耳鸣的发生机制与动物模型评价方法△

韩丽丽 刘存志 石广霞

耳鸣作为一种主观感觉，难以对其进行客观评价；耳鸣动物模型较难研制成功，这限制了耳鸣的机制研究及其治疗方法的发展。本文就耳鸣的发生机制以及动物模型的评价方法进行了总结，为建立合理的动物模型及其评价方法提供思路和依据。目前，耳鸣机制的研究重点由外周听觉系统向中枢神经系统转移。常用的耳鸣模型评价方法主要分为行为学评价和生理学评价2种。

耳鸣是指在没有任何外界刺激条件下耳内或颅内产生的异常声音感觉，为临床常见病，既可以是多种疾病综合征的一种表现，也可以是一个单独的病证，是当今公认的世界难治性疾病之一［1］。美国成年人耳鸣的发病率约25.3％［2］。45～79岁日本人耳鸣的患病率约11.9％，其中0.4％因严重耳鸣导致生活质量下降［3］。高龄、吸烟、高血压、听力损伤、噪声暴露等与耳鸣密切相关。随着生活方式的变化和人口老龄化的不断加剧，环境噪声的增加，耳鸣的发病率逐年升高，严重影响患者的生活质量，给患者带来极大的痛苦，引起社会和医学界的广泛关注。本文主要就耳鸣机制及动物模型成功与否的评价方法进行了总结。

1 耳鸣的发生机制

耳鸣的发病机制目前尚未明确。早期认为耳蜗的功能异常是其主要产生机制。研究发现，切断听神经仍不能完全消除耳鸣症状，部分耳鸣发生在听神经切断术后。Jastreboff等［4］认为，耳鸣产生于听觉皮质下中枢对神经末梢微弱信号的觉察和处理过程中，与自主神经系统（autonomic nerve system）和边缘系统（limbic system）密切相关。Engineer等［5］在噪声诱导的耳鸣大鼠体内植入电极，用简短的脉冲刺激迷走神经（vagus nerve stimulation，VNS），重复匹配音调，可以完全消除实验大鼠耳鸣相关的症状。该实验为耳鸣的治疗提供了新的思路。目前，耳鸣机制的研究重点向中枢神经系统转移，普遍认为耳鸣发生早期病变可能在耳蜗，但主要病理过程和后期结果在中枢，其中大脑皮层和边缘系统参与了耳鸣的产生与持续［6］。

1.1 听觉传导通路传入信号的改变引起听觉中枢可塑性变化

苏文玲等［7］观察到耳鸣大鼠听觉皮质中神经元功能可塑性基因生长相关蛋白-43（growth-associated protein-43，GAP-43）和细胞骨架活性调节蛋白（activity re-gulated cytoskeleton associated protein，ARC）阳性神经元的表达增加，推测它们在耳鸣中起重要作用。贾明辉等［8］发现神经元功能可塑性标记物——快反应基因c-fos和N-甲基-D-天门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）亚型NR2A在耳鸣大鼠听觉皮质的表达明显增多，表明神经递质及受体可能参与了耳鸣的发生，提示耳鸣大鼠听皮质中神经电活动的异常与功能可塑性改变有关。Arg3.1是一种可被迅速诱导的即刻早期基因（immediate-early genes，IEGs），可作为活性神经元的标记并参与神经元突触可塑性的维持［9］。魏婷婷等［10］研究发现，耳鸣大鼠听觉脑干中Arc/arg3.1基因的表达呈动态变化，提示听觉脑干神经元发生了可塑性改变，可能与耳鸣的发生密切相关。Su等［11］研究发现，水杨酸钠能够改变丘脑内侧膝状体（medial geniculate body，MGB）神经元固有特性并减少其突触传导，进而导致丘脑到听觉皮质的传输信号异常产生耳鸣。

1.2 神经递质的改变 微透析技术发现耳鸣的产生与下丘内谷氨酸水平升高和氨基丁酸水平降低可能有关［12］。陈林等［13］采用全细胞膜片钳（the whole-cell patch-clamp）技术观察到水杨酸钠可显著抑制γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）神经元的自发活动水平，通过提高中枢听觉系统的兴奋性诱导耳鸣。

1.3 耳鸣与听觉皮质、边缘系统等大脑区域的关系 fMRI研究发现，耳鸣患者与正常对照组边缘系统相关脑区在功能及结构上存在明显差异，腹正中前额皮质（ventromedial prefrontal cortex，vmPFC）的血氧水平依赖（blood oxygen level-dependent，BOLD）反应与耳鸣患者的主观响度和持续时间等特征呈正相关［14］；研究结果也解释了耳鸣患者的各种情绪等心理障碍。近期一项临床研究中，Zirke等［15］对慢性耳鸣患者采用复合性国际诊断问卷（Comprehensive International Diagnostic Interview，CIDI），结果显示约半数的慢性耳鸣患者伴有心理障碍，其中包括情感障碍、焦虑及躯体形式障碍等。

总之，目前认为耳鸣是一种以听觉外周和听觉中枢病变为主、多因素共同作用的临床症状，听觉传导途径中的神经元电活动异常是耳鸣产生的基础，边缘系统与自主神经系统参与了耳鸣的形成过程。

2 耳鸣动物模型的评价方法

水杨酸盐、奎宁和噪声等均能诱导动物耳鸣的发生［16-19］。制作耳鸣动物模型的成功与否需要经科学评价后确定，常用的评价方法包括行为学评价和生理学评价2种。

2.1 行为学评价 检测耳鸣的行为学方法有多种，但所选择的行为必须是动物容易习得，比如处理障碍物、舔东西、饮水或爬行等。实验中动物表现出一种对声音刺激的反应，而在无声状态下表现出与此不同的反应。经过一定时间，动物会很熟练地对声音刺激和无声状态做出不同的反应。训练成功的动物接受耳鸣诱导物干预，如耳毒性药物或噪声刺激，干预后的动物再次接受上述训练，观察它们对无声状态的反应。如果动物“患有”耳鸣，则它们对无声状态的反应很可能与之前有声音刺激下的反应相同。

Jastreboff在1988年首次利用动物对声音和无声状态下做出的不同反应，证实了注射水杨酸的大鼠确实感受到耳鸣。实验首先训练口渴的大鼠在声音状态下饮水，无声状态下停止饮水，观察水杨酸诱导耳鸣的大鼠在“无声音刺激”条件下做出的反应。若大鼠发生了耳鸣，它将感受不到恐惧信号（无声）的提示因而继续饮水［17］。水杨酸盐诱导耳鸣模型的成功验证推动了耳鸣的机制研究。Guitton等［20］利用跳台逃避实验检测大鼠是否存在耳鸣。实验中首先训练大鼠在10Hz（水杨酸盐所致耳鸣约为10Hz）的声音下爬上跳台。制作模型后，将大鼠置于无声音刺激的试验箱中，耳鸣大鼠则继续爬上跳台。Rüttiger等［21］将声音刺激与奖励建立条件反射，训练大鼠在噪声刺激时给予糖水奖励，无声条件则不予奖励。水杨酸盐诱导耳鸣后，将大鼠置于无声音刺激的试验箱中，如果大鼠发生耳鸣则将继续舔舐糖水。Lobarinas等［22］训练烦渴大鼠形成“声刺激—饮水停止”的条件反射，药物诱导大鼠耳鸣后，在无声音刺激情况下不能停止饮水，则证明耳鸣模型成功。

Turner等［23］基于惊吓可以由噪声产生及噪声大小可以被背景白噪声抑制的事实，制作了大鼠耳鸣的声音惊吓刺激反射（whole-body startle reflex，WBS反射）行为模型，其中耳鸣可以填补空白噪声进而减少背景白噪声对惊吓的掩蔽程度。与上述模型相比，该模型无需进行训练，节省了大量时间。由于惊吓反射不依赖于习得行为，对记忆改变和动机状态的影响并不明显，因而惊吓结果是由噪声引起的可能性较大。该实验不足之处在于，惊吓反射中枢位于脑干下部，涉及耳蜗神经核、外侧丘系及脑桥网状结构，因此，与耳鸣相同中枢水平的听力丧失和听觉过敏可能影响实验结果，需要设计对照试验排除。豚鼠（guinea pig）的听觉系统在哺乳动物中较为典型，其低频听力与人类的非常相似，因此是研究听觉系统疾病的良好实验对象。但豚鼠不宜习得复杂训练，Berger等［24］对Turner实验进行了改进，用Preyer反射代替WBS反射来测量动物的惊吓刺激，使之适合于豚鼠的研究。

国内李明等［25］建立食物抑制法耳鸣动物模型。背景噪声停止为条件刺激，电击为非条件刺激。经强化训练后形成“背景噪声停止—摄食减少或停止”的条件反射。观察动物不再给予电击后条件反射的消退时间，以判断动物是否产生了耳鸣。贾明辉［26］等改进饮水抑制法评价耳鸣动物模型是否成功。腹腔注射水杨酸钠的大鼠适应性喂养1周后禁水2 d，将干渴的动物置于隔声室内进行条件反射训练（夜晚进行），以背景噪声停止为条件刺激，电击为非条件刺激，条件刺激出现前后各1min动物的舔水时间作为观察指标。经强化训练后形成“背景噪声停止—舔水减少”条件反射。最后，所有动物不再给予电击，观察条件反射的消退时间，用“舔水时间”代替“舔水率”判断动物是否发生了耳鸣。张恩柱等［27］建立跳台反射法耳鸣动物行为学模型，动物于隔音室内进行条件反射训练。经10～14 d的强化训练后，动物形成“声刺激—跳台逃避”的条件反射。条件反射建立后动物给药，记录动物在给声期间和刺激间期跳上跳台的次数。跳台法耳鸣动物模型可有效验证水杨酸对动物耳鸣的产生。

行为学评价的模型可以明确实验动物耳鸣的精神物理学特性，如音高、响度和耳鸣发生的时间进程等。但该评价方法比较耗费时间，每只动物在耳鸣之前的训练需要几周时间达到对声音和无声状态刺激做出不同的反应。此外，需要设计对照试验以排除耳鸣可能造成的其他病理状态，如听力丧失、听觉过敏、动机异常、记忆改变等。

2.2 生理学评价 耳鸣通常是无外界声源刺激下对声音的感知，多数观点认为这是由于神经自发活动导致的。生理模型可用于检测与耳鸣相关的神经活动，包括直接记录的电生理活动，采用小动物正电子断层扫描仪（micro positron emission tomography，microPET）和锰离子加强磁共振成像（manganese enhanced magnetic resonance imaging，MEMRI）检测相关神经活动，分析听觉中枢的变化，可以很好地对耳鸣进行定性和定位检测，常用于耳鸣发生机制的研究［28-29］。其缺点是不能直接证明动物“患有”耳鸣，而是从各种变化中予以推断。

黄治物等［30］采用电生理学方法，以耳蜗神经活动的平均谱（average spectrum of electrophysiological cochleoneural activity，ASECA）为客观监测指标，评价长期注射水杨酸盐建立的耳鸣动物模型，发现在耳鸣动物模型中检测到的ASECA特征性变化可作为耳鸣的客观指征。

生理学评价着重于分析与耳鸣相关的神经系统变化，用于耳鸣的定性、定位研究，观察中枢水平信号的变化以解释耳鸣的发生机制，同时为耳鸣的检测提供客观指征。

3 展望

目前研究多认为耳鸣是一种“全系统疾病（system-wide）”，听觉系统和非听觉系统（如躯体感觉系统、边缘系统等）均参与其中。运用客观的评价方法筛选出合理的耳鸣动物模型可进一步推动耳鸣发生机制的研究，以利于寻求更为有效的干预方法。

［1］David Jiang.耳鸣及其美国的诊治指导方案［J］.中国听力语言康复科学杂志，2005，（1）：58-61.

［2］Shargorodsky J，Curhan GC，FarwellWR.Prevalence and characteristics of tinnitus among US adults［J］.Am J Med，2010，123（8）：711-718.

［3］Fujii K，Nagata C，Nakamura K，et al.Prevalence of tinnitus in community-dwelling Japanese adults［J］.J Epidemiol，2011，21（4）：299-304.

［4］Jastreboff PJ，Hazell JW.A neurophysiological approach to tinnitus：clinical implications［J］.Br JAudiol，1993，27（1）：7-17.

［5］Engineer ND，Riley JR，Seale JD，et al.Reversing pathological neural activity using targeted plasticity［J］.Nature，2011，470（7332）：101-104.

［6］Rauschecker JP，Leaver AM，Mühlau M.Tuning out the noise：limbic-auditory interactions in tinnitus［J］.Neuron，2010，66（6）：819-826.

［7］苏文玲，赵德安，高兴强，等.耳鸣模型大鼠听皮层生长相关蛋白-43和细胞骨架活性调节蛋白的表达［J］.听力学及言语疾病杂志，2010，18（4）：320-323.

［8］贾明辉，秦兆冰.c-fos及NR2A在耳鸣大鼠听皮层中的表达［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2006，41（6）：451-454.

［9］Panford-Walsh R，SingerW，Rüttiger L，et al.Midazolam reverses salicylate-induced changes in brain-derived neurotrophic factor and arg3.1 expression：implications for tinnitus perception and auditory plasticity［J］.Mol Pharmacol，2008，74（3）：595-604.

［10］魏婷婷，赵德安，高兴强，等.Arc/arg3.1基因在耳鸣大鼠模型听觉脑干中的表达情况［J］.山东大学耳鼻喉眼学报，2010，24（1）：21-24.

［11］Su YY，Luo B，Jin Y，et al.Altered neuronal intrinsic properties and reduced synaptic transmission of the rat’s medial geniculate body in salicylate-induced tinnitus［J］.PLoS One，2012，7（10）：46969

［12］刘俊秀，马芙蓉，李学佩，等.水杨酸钠对大鼠下丘内谷氨酸和γ-氨基丁酸的影响［J］.中华耳科学杂志，2009，7（3）：212-215.

［13］陈林，王海涛，陆云刚，等.水杨酸钠诱导耳鸣的神经机制［J］.中国科学技术大学学报，2008，38（8）：986-995.

［14］Seydell-Greenwald A，Leaver AM，Turesky TK，et al.Functional MRIevidence for a role of ventral prefrontal cortex in tinnitus［J］.Brain Res，2012，1485：22-39.

［15］Zirke N，Seydel C，Arsoy D，et al.Analysis ofmental disorders in tinnitus patients performed with Composite International Diagnostic Interview［J］.Qual Life Res，2013.Epub ahead of print.

［16］Jastreboff PJ，Sasaki CT.Salicylate-induced changes in spontaneous activity of single units in the inferior colliculus of the guinea pig［J］.JAcoust Soc Am，1986，80（5）：1384-1391.

［17］Jastreboff PJ，Brennan JF，Coleman JK，et al.Phantom auditory sensation in rats，an animalmodel for tinnitus［J］.Behav Neurosci，1988，102（6）：811-822.

［18］Zhang JS，Kaltenbach JA.Increases in spontaneous activity in the dorsal cochlear nucleus of the rat following exposure to high intensity sound［J］.Neurosci Let，1998，250（3）：197-200.

［19］Kaltenbach JA，Zacharek MA，Zhang JS，et al.Activity in the dorsal cochlear nucleus of hamsters previously tested for tinnitus following intense tone exposure［J］.Neurosci Let，2004，355（1/2）：121-125.

［20］Guitton MJ，Caston J，Ruel J，et al.Salicylate induces tinnitus through activation of cochlear NMDA receptors［J］.J Neurosci，2003，23（9）：3944-3952.

［21］Rüttiger L，Ciuffani J，Zenner，HP，etal.A behavioral paradigm to judge acute sodium salicylate-induced sound experience in rats：a new approach for an animalmodal on tinnitus［J］.Hear Res，2003，180（1/2）：39-50.

［22］Lobarinas E，Sun W，Cushing R，et al.A novel behavioral paradigm for assessing tinnitus using schedule-induced polydipsia avoidance conditioning（SIP-AC）［J］.Hear Res，2004，190（1/2）：109-114.

［23］Turner JG，Brozoski TJ，Bauer CA，et al.Gap detection deficits in rats with tinnitus：a potential novel screening tool［J］.Behav Neurosci，2006，120（1）：188-195.

［24］Berger JI，Coomber B，Shackleton TM，et al.A novel behavioural approach to detecting tinnitus in the guinea pig［J］.J Neurosci Methods，2013，213（2）：188-195.

［25］李明，杨光，关颖，等.耳鸣动物行为学模型的制作［J］.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2003，11（3）：108-111.

［26］贾明辉，秦兆冰.耳鸣动物行为学模型的制作［J］.听力学及言语疾病杂志.2007，15（1）：73-75.

［27］张恩柱，宋为明，刘俊秀，等.跳台反射法耳鸣动物行为学模型的建立［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2007，14（3）：161-164.

［28］Lobarinas E，Sun W，Stolzberg D，et al.Human brain imaging of tinnitusand animalmodels［J］.Semin Hear，2008，29（4）：333-349.

［29］Brozoski TJ，Ciobanu L，Bauer CA.Central neural activity in rats with tinnitus evaluated withmanganese-enhanced magnetic resonance imaging（MEMRI）［J］.Hear Res，2007，228（1/2）：168-179.

［30］黄治物，吴展元，陈平，等.实验性耳鸣动物模型的建立［J］.中国病理生理杂志，2004，20（12）：2363-2364，2368.

2012-12-25）

（本文编辑 杨美琴）

北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划（2011-3-055）

首都医科大学附属北京中医医院耳鼻喉科 北京 100010

刘存志（Email：lcz623780＠126.com）

现为天津中医药大学2010级硕士研究生 天津 300193

试题9.答案：C。黄斑水肿是葡萄膜炎最常见的并发症，也是葡萄膜炎导致视力下降及失明的主要原因，多见于全葡萄膜炎及中间葡萄膜炎，少见于前葡萄膜炎。此外，视网膜下新生血管膜、黄斑前膜及黄斑萎缩也都可并发于葡萄膜炎。

试题10.答案：C。PRL是使视觉最优化的视网膜注视点。当黄斑中心凹受损时，一个或多个中心凹周边的视网膜区域可以充当旁中心注视的作用，此区域即为优选的视网膜注视点；少数患者不通过训练就能很好地利用PRL提高视功能，但大多数患者必须通过训练形成稳定的固视区，才可有效提高视功能。