张承旻(综述)，廖文波(审校)

(遵义医学院附属医院 骨二科，贵州 遵义 563099)

·综述·

异种骨去抗原处理的研究进展

张承旻(综述)，廖文波(审校)

(遵义医学院附属医院 骨二科，贵州 遵义 563099)

异种骨；免疫原性；抗原；脱细胞骨基质

创伤、肿瘤、感染及其它因素可以导致骨缺损，而骨移植是治疗骨缺损最有效的方法之一[1]。用于骨移植的材料有：自体骨、同种异体骨、异种骨及组织工程化骨等。自体骨及同种异体骨是目前临床主要应用的骨移植材料，但均有其不足之处[2-5]。近年来的研究表明，异种骨具有天然的三维孔隙结构、恰当的钙磷比例、骨诱导能力及生物力学与人相似[6-7]，是理想骨移植材料的来源。但其为异种材料，植入人体内可引起急性排斥反应。因此,如何降低异种骨免疫原性是其成为骨移植代替材料的关键。现就目前异种骨去抗原处理方法的研究进展进行详细综述。

1 异种骨抗原分布及免疫反应类型

异种骨主要含有抗原：α-半乳糖基抗原(α-Gal)、主要组织相容性抗原(MHC)、胶原蛋白及骨髓和血液成分[8-9]。异种材料植入人体后，与人体血液直接接触，激活血液内含有的α-半乳糖基天然抗体，其所介导的细胞毒效应，引起移植物血管内皮细胞溶破、血栓形成及炎症反应，导致超急性排斥反应；但是异种骨移植后并不直接暴露于血液中，所以异种骨移植后并不出现明显的超急性排斥反应。由于异种材料与人体的MHC分子差异较大，细胞因子及其受体不匹配，难以通过直接识别途径激发免疫应答，所以排斥反应主要通过间接识别途径而发生。通过CD4+Th细胞识别自身抗原提呈细胞提呈的异种MHC-II单态和多态决定簇，通过Th1、Th2细胞作用，发生急性排斥反应。较同种排斥相比，其反应更强烈，不易被免疫抑制剂所抑制。目前认为异种骨移植引起排斥反应主要是α-Gal抗原[10-11]和MHC抗原[12]，通常认为I型胶原蛋白各种属之间差别不大，并没有很强的抗原性。其中α-Gal、MHC-I抗原表达于骨髓细胞及骨细胞、成骨细胞细胞膜上及哈弗氏管周围，MHC-II抗原表达于骨髓细胞。所以如何更好的制备脱细胞异种骨支架材料是降低异种骨免疫原性的主要方式。

2 异种骨去抗原处理方法

异种骨去抗原主要是通过脱细胞处理，处理目的是有效的去除所有细胞及核质，并将对支架的组成成份、生物活性和机械完整性的干扰减到最弱以保留基质成分[13]。目前任何处理脱细胞处理方式都将影响支架材料的生物特性，常用的方法包括物理、化学方法[14-16]。物理方法分为：高温煅烧、低温冷冻、机械搅拌及声波降解等方法，这些方法破坏细胞膜使细胞内成份释放，然后进一步从支架上去除细胞内成分。但是，仅仅应用物理方法并不能完全去除细胞，一般需联合化学方法。此外，蛋白酶可以水解细胞与细胞、细胞与支架之间的纤连蛋白、弹性蛋白和黏多糖等连接成分，使细胞与支架分离，从而达到脱细胞目的[17]。目前对异种去抗原处理方法通常采用不同的物理、化学及酶方法联合使用，但是各种方式对异种骨支架的脱细胞处理同时也不同程度的影响到了异种骨材料天然生物特性。如H2O2可以有效的降低异种骨的免疫原性，但是在免疫原性减低的同时异种骨的强度、弹性模量也受到了影响，其弹性变形能力较差，脆性增加。

2.1 物理方法 异种骨物理处理方法有高温煅烧、低温冷冻及超声等方法。高温煅烧骨是将异种骨脱脂脱蛋白处理后在经过高温煅烧，除去了胶原等有机成分使异种骨的免疫原性减低。经过煅烧的异种骨主要成分是高纯度的羟基磷灰石，因为有机成分都被除去，所以高温煅烧后可使骨力学强度低、脆性大、可降解。Kim等应用高温煅烧骨在体外及动物体内诱导成骨，认为其具有较强的骨传导性，但是无骨诱导性[18]。Lin等将异种骨放入焦磷酸钠溶液中浸泡后高温煅烧，骨中的羟基磷灰石与焦磷酸钠反应转变成为磷酸钠三钙，提高了高温煅烧骨的生物降解性与细胞相容性[19]。由于高温煅烧降低了骨的力学性能，所以一般不用于负重部位植骨，因其可诱导骨生成，常作为填充材料。

低温冷冻是一种常用的脱细胞处理方法，一般推荐温度低于-70～-80 ℃。低温冷冻使异种骨免疫原性减低，其机制并不十分明确，有学者认为低温时细胞内生成的冰晶，可以破坏细胞膜引起细胞的溶解，从而降低了异种骨的免疫原性[20]。于洪波等将兔成骨细胞液氮冻存3月后复苏，比较冻存前后细胞的MHC分子的表达，发现冻存后细胞的MHC-I分子的表达减低，认为冻存可以降低细胞的免疫原性。但是，低温冷冻方法对异种骨材料的生物力学影响具有争议，Kang等通过实验认为低温冷冻及反复冻融对牛皮质骨条生物力学无明显的影响[21]。

超声生物技术包括超声碎细胞和超声洗涤等技术，在生物研究领域应用广泛。超声波可以引发强烈的震动，同时还有高速化、空化效应和搅拌作用。在一定的强度和频率条件下超声波在液体中传播产生许多微小气泡，暴露在声场中的气泡先迅速膨胀到最大半径，然后被迅速压缩并瞬间崩溃闭合产生瞬时的高温、高压及强烈的冲击波与激射流将细胞击碎。目前的研究尚没有一个统一的频率和强度来破坏细胞[22]，赵自平等采用20kHz的较低频率进行超声碎细胞处理，然后采用40kHz的频率清除细胞碎片，经过联合化学法脱脂脱蛋白处理，所制备的异种骨脱细胞支架经过检测，生物力学与传统方法相比生物力学没有差异，经过体外及动物体内检测，经过超声处理的异种骨脱细胞支架免疫原性低、细胞相容性好。较常规方法，超声方法协助处理脱细胞更彻底，而且缩短了异种骨支架材料制备周期，不影响支架材料的生物力学性能[23]。探索超声去除异种松质骨抗原的最佳频率与强度，这是研究该应用技术的关键和重点。

2.2 化学方法 化学方法对异种骨支架材料进行脱脂、脱蛋白或脱细胞处理，主要是采用不同化学试剂浸泡异种骨，如：甲醇、氯仿、乙醚、过氧化氢。通过不同试剂共同作用制备部分脱蛋白骨、完全脱脂脱蛋白骨及脱细胞骨基质等。常用的脱脂化学试剂有乙醚、氯仿、甲醇及甲醛等有机溶剂，脱蛋白试剂有过氧化氢、乙二胺等。

1937年首次出现脱蛋白骨应用于临床后[24]，化学法脱脂脱蛋白技术在不断更新，其中完全脱脂脱蛋白骨：Bio-oss骨、Oswestry骨等已应用于临床并取得了一定的效果，但是都未能广泛应用[25-26]。完全脱脂脱蛋白通常将异种骨浸泡于过氧化氢液或乙二胺中，从而提取其中蛋白成分。经过完全脱脂脱蛋白处理后异种骨的免疫原性明显下降，实验证明移植后不会引起强烈的排斥反应，但是同时因为骨支架中的有机成分几乎全部被清除掉，经过处理的支架材料几乎没有骨诱导性。在成骨方面受到了限制。Kiel骨是一种脱脂部分脱蛋白的异种骨，其采用新鲜牛骨，机械方式去除软组织及骨髓，浸泡于H2O2中去除部分蛋白，再用乙醇脱脂处理后干燥获得。经过处理后的骨支架材料免疫原性低，因为部分脱蛋白，支架材料上仍保留部分蛋白成分，提高了支架材料的骨诱导作用。在欧洲Kiel骨已经商品化应用与临床[27]。

在脱脂脱蛋白处理中，采用H2O2进行脱蛋白处理非常普遍，但是实验发现H2O2作用时间越长，异种骨支架的免疫原性也就越低，但是支架材料的生物力学强度也明显的降低[28]。在骨基质中氨基酸总量随着H2O2处理时间的延长并没有明显的变化，没有出现大量蛋白质被去除的现象。所以目前认为H2O2作用机制可能是其强氧化作用使得支架材料上的蛋白发生变性，并没有起到脱蛋白的作用。异种骨中的主要有机成分I型胶原蛋白是维持骨韧性重要成分，其在H2O2作用下发生变性，可使得异种骨的脆性增加，强度降低[29]。

非离子洗剂Triton X-100是一种广泛使用的脱细胞洗剂，作用时间根据不同的组织从几个小时到两周。它主要是通过破坏脂类之间和脂类与蛋白之间的相互作用，经过处理后除去了基质材料上的脂类，有效保留了蛋白物质。用Triton X-100处理血管可以有效的除去血管内的细胞并保存血管的结构。王昊等采用Triton X-100处理异种骨，经过免疫组织化学检测异种骨中胶原蛋白被保留；HE染色间骨陷窝空虚，骨细胞被除去；力学检测经过处理的异种骨支架材料与正常骨相似[30]。但是Triton X-100脱细胞处理的过程中同时除去了支架材料中的黏多糖成分，不利于细胞的粘附[31]。

采用化学法降低异种骨材料的免疫原性主要是通过将异种骨浸泡于不同的试剂中，但是单纯的浸泡一方面提取液不易达到异种骨内部，另一方面提取液随着作用时间的延长，其浓度降低。一般采用物理搅拌、震荡及超声等方法与化学法联合应用，可以明显提高化学试剂的作用效率，缩短处理时间。

2.3 酶消化法 胰酶为蛋白酶的一种，作为消化酶而起作用。是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，从而起到消化酶的作用。胰酶可以使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。经常作为一种脱细胞的处理方法。何创龙等采用蛋白酶代替H2O2等强氧化剂处理异种骨，有效的保留了胶原蛋白[32]。但是胰酶等蛋白酶长时间作用会清除异种骨中的连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和黏多糖等成分。此外，使用蛋白酶需要控制提取液的pH值及温度等条件，使得蛋白酶可以有效的发挥其作用。

3 展望

异种骨来源广泛可以大量提供，天然的骨结构及其孔隙有利于细胞的粘附及增殖，生物力学与人骨相似，较其它来源的植骨材料有着其自身的优势，可成为理想的骨替代材料[33]。现有的物理、化学及酶的处理方式可以有效的降低异种骨的免疫原性，但同时影响了异种骨的骨传导性、骨诱导性及生物力学性能等天然特性。由于这个原因，异种骨在作为骨代替材料的应用上受到了明显的限制。因此，目前需要解决的首要问题是如何有效的降低异种骨免疫原性，并且最大限度的保护异种骨的天然特性。

[1] Li M W,Zhou X S. Histologic and Biomechanical Studies of Tendon-To-Bone Healing After Autologous and Allogeneic Bone Transplants [J].Exp Clin Transplant， 2012, 20 (4):34-39.

[2]Chotivichit A, Korwutthikulrangsri E, Auewarakul C, et al. Core decompression and concentrated autologous bone marrow injection for treatment of osteonecrosis of the femoral head [J].Med Assoc Thai,2012,95(9):14-20.

[3]Niikura T, Lee S Y,Sakai Y,et al.Radiation-associated fracture nonunion of the clavicle treated with locking plate fixation and autologous bonegrafting[J].Case Rep Med，2012,47:540-50.

[4]Henman P,Finlayson D. Ordering allograft by weight: suggestions for the efficient use of frozen bone-graft for impaction grafting [J]. Arthroplasty, 2000, 15:368-371.

[5]Riggenbach M D,Jones G L, Bishop J Y.Open reduction and internal fixation of clavicular nonunions with allograft bone substitute[J].Int J Shoulder Surg，2011,5(3):61-67.

[6]Kneser U, Stangenberg L, Ohnolz J, et al. Evaluation of processed bovine cancellous bone matrix seeded with syngenic osteoblasts in a critical size calvarial defect rat model[J].Cell Mol,2006,10:695-707.

[7]Accorsi-Mendonca T,Conz M B,Barros T C,et al.Physicochemical characterization of two deproteinized bovine xenografts[J].Braz Oral Res,2008,22:5-10.

[8]Long B, Dan L, Jian L,et al. Evaluation of a novel reconstituted bone xenograft using processed bovine cancellous bone in combination with purified bovine bone morphogenetic protein [J]. Xenotransplantation,2012,19(2):122-132.

[9]Naso F,Gandaglia A,Iop L,et al.Alpha-Gal detectors in xenotransplantation research: a word of caution [J]. Xenotransplantation,2012,19(4):215-220.

[10] Nasr I W,Wang Y,Gao G ,et al.Testicular immune privilege promotes transplantation tolerance by altering the balance between memory and regulatory T cells [J]. Immunology,2005,174:6161-6168.

[11]Hollinger J O,Schmitz J P,Mark D E.Osseous would healing with xenogeneic bone implants with a biodegradable carrier[J].Surg,2006,105:150-162.

[12]Seebach J D,Comrack C,Germana S.HLA-Cw3 expression on porcine endothelial cells protects against xenogeneic cytotoxicity mediated by a subset of human NK cells [J].Immune，2007,159:3655-61.

[13]段海平,郑永唐,达天武.脱抗原牛角胎骨移植家兔后的特异性免疫反应[J].免疫学杂志,2002,15(3):204-20.

[14]Trentz O A,Hoerstrup S P,Sun L K,et al.Osteoblasts response to allogenic and xenogenic solvent dehydrated cancellous bone in vitro[J].Biomaterials,2003,24:3417-3426.

[15]Jansen E J,Sladek R E,Bahar H,et al.Hydrophobicity as a design criterion for polymer scaffolds in bone tissue engineering[J].Biomaterials,2005,26:4423-4431.

[16]Haas R,Haidvogl D,Do¨rtbudak O,et al.Freeze-dried bone for maxillary sinus augmentation in sheep. Part II: biomechanical findings [J]. Clin Oral Implants Res,2002,13:581-586.

[17]McFetridge P S,Daniel J W,Bodamyali T,et al.Preparation of porcine carotid arteries for vascular tissue engineering applications[J].J Biomed Mater Res,2004,70:224-34.

[18]Kim S H，Shin J W, Park S A,et al.Chemical, structural properties, and osteo conductive effectiveness of bone block derived from porcine cancellous bone[J].Biomed Mater Res B AppI Biomater,2004,68(l):69-74.

[19]Lin F H,Liao C J,Chen K S,et al.Preparation of a biphasic porous bioceramic by benting bovine cancellous bone with Na4P2O710H2O addition Biomaterials[J].Biomaterials,1999,20(5):475-484.

[20]Thomas W,Gilbert,Tiffany L,et al.Decellularization of tissues and organs[J].Biomaterials,2006,27(19):3675-3683.

[21]Kang Q, An Y H, Friedman R J.Effects of multiple freezing-thawing cycles on ultimate indentation load and stiffness of bovine cancellous bone[J].Am J Vet Res,1997,58(10):1171-1173.

[22]Dahl S L,Koh J,Prabhakar V,et al.Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation[J].Cell Transplant,2003,12:659-666.

[23]赵自平,吴少坚,欧宣成,等.超声脱细胞异种松质骨材料的制备及性能检测[J].中国医学工程,2009,17(5):321-325.

[24]Orell S.Surgical bone grafting with as purum as novum and boiled bone [J]. Bone Joint Surg,1937,19(10):873-878.

[25]Schou S,Holmstrup P,Jørgensen T,et al.Anorganic porous bovine-derived bone mineral (Bio-Oss) and ePTFE membrane in the treatment of peri-implantitis in cynomolgus monkeys [J].Clin Oral Implants Res,2003,14:535-547.

[26]Salama R,Weissman S L.The clinical use of combined xenografts of bone and autologous red marrow. A preliminary report[J].Bone Joint Surg,1978,60:111-115.

[27]Mcmurray G N.The evaluation of Kiel bone in spinal fusions [J]. Bone Joint Surg,1982,64:101-104.

[28]罗卓荆,胡蕴玉,王茜,等.H2O2浸渍对牛松质骨力学特性的影响[J].中华骨科杂志,1997，17(11):714-716.

[29]L.E.A.Kanim, Hyun Bae, Edgar G,et al.Inter and intravariability of BMPs in commercially available demineralized bone matrices, Proceedings of the NASS 18th Annual Meeting[J].The Spine Journal，2003,(3):167-171.

[30]王昊,柏树令.骨脱细胞后的有机成分分析[J].中国修复重建外科杂志，2003,17(5):422-424

[31]Grauss R W,Hazekamp M G,Oppenhuizen F,et al.Histological evaluation of decellularised porcine aortic valves: matrix changes due to different decellularisation methods[J].Eur J Cardiothorac Surg,2005,27:566-71.

[32]何创龙,王远亮,杨立华,等.Kiel骨理化性能的实验分析[J].重庆大学学报，2004,27(7):40-44.

[33]He Q Y,Li Q H,Xu J Z.Immortalization of human articular chondrocytes and their characteristics[J].Tissuengineering,2006,12(4):1123.

[收稿2012-09-26;修回2012-12-28]

(编辑：王福军)

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A

1000-2715(2013)02-0170-04

廖文波,男,博士,教授,硕士生导师,研究方向:骨质疏松, E-mail:wenbo600@sina.com。