刘 楠， 李 岩， 牛振华综述， 于雪凡审校

细胞凋亡是一种相对有序的能量依赖的程序化死亡过程，广泛存在于多细胞生物的各种器官和组织中。截止到目前，细胞凋亡通路主要有:死亡受体活化(外源性途径)途径、线粒体损伤途径(内源性途径)和内质网应激诱导的凋亡途径。前两者是经典凋亡途径，内质网应激途径是近年来才发现的一种新的凋亡途径。

内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞中重要的细胞器，它由封闭的膜系统及其围成的腔形成互相沟通的网状结构，对细胞正常功能的维持至关重要。内质网在调节膜蛋白、分泌蛋白的折叠与加工、钙的储存与释放方面具有重要的作用。内质网同时也是类固醇、胆固醇和脂质的合成部位。研究表明，当内质网固有蛋白折叠或加工过程受阻、钙离子稳态被打破时，细胞将发生致死性的损害［1］。缺血/缺氧、钙超载、氧化应激等均可导致未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网聚集，引起内质网功能障碍，从而触发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。研究证实，许多神经系统疾病均与内质网功能障碍有关，包括缺血性脑卒中、阿尔兹海默病、帕金森病等。本文就内质网应激介导的神经细胞凋亡信号通路进行如下综述。

1 未折叠蛋白反应

内质网应激时，细胞通过启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)特异信号系统抑制蛋白翻译，促进未折叠蛋白加工成熟和促进错误折叠蛋白降解，减轻ER蛋白负荷并促进细胞重建内质网稳态。能够感知ER腔内未折叠蛋白聚集的感受器主要是3个ER跨膜蛋白，即PERK(PKR-like ER kinase)、IRE1α(inositol requiting enzyme 1α)及 ATF6(activating transcription factor 6)。生理状态下，内质网分子伴侣GRP78/BIP(glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein)分别与PERK、IRE1α、ATF6暴露于ER腔中的结构域结合，处于非活化状态。内质网功能障碍时，未折叠蛋白大量聚集，GRP78便与PERK、IRE1α、ATF6解离，转而与未折叠蛋白结合，由此促进蛋白质的正确折叠。PERK、IRE1α与GRP78解离后发生二聚化和自身磷酸化，从而被激活。PERK激活后特异性的磷酸化真核起始因子2的α亚单位(eIF2α)。磷酸化的eIF2α有抑制翻译起始因子的功能，从而抑制大多数mRNA的翻译、减少蛋白质的合成。

IRE1α被自身磷酸化激活后具有核酸内切酶活性，激活的IRE1α能从XBP-1 mRNA中特异性剪切26个碱基的内含子，改变XBP-1 mRNA的开放阅读框，其翻译产物XBP-1能促进含ERS反应元件(endoplasmic reticulum stress responsive element，ERSE)的UPR靶分子如GRP78、GRP94表达，以减轻或中止ERS反应，从而恢复细胞内环境稳态。研究证实［2］，XBP-1是UPR重要的转录激活剂，对神经细胞具有保护作用。

与GRP78解离后，ATF6以囊泡转移的方式从内质网转移到高尔基体，在高尔基体内被丝氨酸蛋白酶S1P(site-1 protease)和S2P(site-2 protease)切割，产生游离的50kD的N端片段，并转移到核内与内质网应激基因的ERSE结合，包括GRP78、GRP94、ERp72、PDI和 CHOP，它们对于内质网功能的恢复是必须的。

综上所述，内质网功能障碍时可通过UPR自我信号转导通路减弱ERS，减少未折叠蛋白的生成。然而，如果ERS严重且持续时间长，UPR最终会启动凋亡通路，导致神经细胞凋亡。

2 内质网应激介导的神经细胞凋亡通路

PERK、ATF6以及IRE-1α信号不仅能够启动ERS的生存途径，严重或长时间的ERS损伤了ER的功能时，这3个信号通路同样能够启动由ERS所介导的凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。然而它们并不是直接引起细胞凋亡的，而是通过激活下游的凋亡信号分子，如CHOP/GADD153、JNK、caspase-12以及GSK-3/3β。研究表明，线粒体功能障碍也是内质网应激介导凋亡的重要促进因子。

2.1 CHOP 通路 CHOP/GADD153(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153)是内质网应激特异的一个转录因子，属于C/EBP转录因子家族成员。CHOP含有一个N端转录激活域和C端的碱性锌指(bZIP)结构域。PERK、ATF6以及IRE1都能诱导CHOP的转录，其中PERK-eIF2α-ATF4是CHOP蛋白表达的主要途径。如上所述，PERK与GRP78解离后发生二聚化和自身磷酸化，从而被激活。PERK激活后特异性的磷酸化eIF2α。内质网应激无法挽救时，大量磷酸化的eIF2α使核糖体到达ATF4的开放阅读框架允许ATF4的转录，ATF4进入细胞核后便激活CHOP的转录。研究发现［3］，PERK信号通路的激活可以减弱Aβ介导的内质网应激，说明PERK-eIF2α通路可以作为神经系统退行性疾病如阿尔兹海默病潜在的治疗靶点。研究还发现［4］，对SH-SY5Y细胞施行IRE1敲除后CHOP的表达下调，表明CHOP是经IRE1激活的重要凋亡分子。

CHOP介导的神经细胞凋亡机制总结如下:(1)下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达:研究发现［5］，CHOP的过度表达造成Bcl-2的下调、细胞内谷胱甘肽的耗竭、活性氧产物积增。(2)调节BIM和PUMA的诱导:最近的一项研究已经证实在ERS诱导的细胞凋亡中，ATF4-CHOP介导的Bcl-2家族成员PUMA的反式激活信号通路的存在。研究者发现ATF-4缺乏的神经元表现出PUMA表达水平的明显下调。此外，ATF4可以诱导转录因子CHOP的表达，反过来CHOP可以激活PUMA的诱导。他们还证实了ERS时CHOP与PUMA启动子结合，并且当CHOP被敲除时减弱了PUMA诱导和神经元凋亡［6］。(3)上调 DR5的表达:DR5编码细胞表面死亡受体，进而激活caspase级联反应。CHOP通过与DR5基因的5’旁侧区结合来调节DR5的转录。人类神经母细胞SHSY5Y细胞经衣霉素诱导后，DR5表达明显增加，这与CHOP的表达上调是一致的，并且两者的上调均可被脑源性神经营养因子抑制［7］。因此，DR5很可能是CHOP下游的凋亡因子。

2.2 JNK通路 JNK属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPKKK)家族，JNK主要介导应激反应，因此又称应激激活蛋白激酶(SAPK)。短暂的JNK可以促进细胞的生存，长期的JNK通路激活可以促进细胞的凋亡。ERS通过 IRE1α-TRAF2-ASK1通路和 MLK(mixed lineage kinases complex)复合体激活JNK通路。

如上所述，UPR时IRE1α与GRP78解离后发生二聚化和自身磷酸化，从而被激活。持续的IRE1α二聚化可导致凋亡信号调节激酶(ASK1)及其下游底物JNK的活化。JNK磷酸化既可以激活凋亡蛋白BIM，又可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2。研究发现［8］，ASK1的小分子调节剂可以保护细胞免受内质网应激诱导的凋亡，说明IRE1α-ASK1-JNK是一条重要凋亡信号通路。ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是MAPK(mitogen-activated protein kinase)家族的一员，可以激活 JNK和 p38信号通路［9］。Nishitoh H等人研究发现［10］，PC12细胞经过毒胡萝卜素(一种内质网应激诱导剂，能够引起UPR)或衣霉素(内质网N-糖基化抑制剂)诱导后可以活化ASK1和JNK，表明ERS激活了ASK1-JNK通路。此外，ASK1与IRE1α只有在TRAF2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2)和毒胡萝卜素都存在的情况下才表现出相关性，这表明ERS诱导了内质网外膜IRE1-TRAF2-ASK1复合体的形成，进而激活了ASK1-JNK信号通路。以上说明ASK1在发生ERS时是主宰细胞命运的关键因素。

MLK是一种通过磷酸化作用激活MAPK通路的丝/苏氨酸蛋白激酶。目前为止，MLK已经有7个家族成员被发现，根据他们的催化亚基不同，又可以分为3个亚家族:MLKs、DLKs和 ZAKs。MLKs包括 MLK1、MLK2(MST)和 MLK3(SPRK/PTK)。MLK3，是分子量为93kD的一个成员，MLK3作为JNK级联上游的重要活化因子，通过直接磷酸化并激活中游MKK4/7蛋白激酶，从而激活JNK应激信号通路［11～13］。MLK3介导了JNK诱导的神经细胞凋亡和脑缺血损伤通路，并因此受到重视。

2.3 caspase-12通路 caspase-12定位于ER外膜，是介导ERS凋亡的关键分子，在死亡受体或线粒体凋亡途径中不被活化。caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可诱导其发生凋亡，表明caspase-12与ERS介导凋亡的机制有关，而与非ERS介导的凋亡无关［14］。ERS时，以下信号通路可以激活caspase-12:(1)Ca2+依赖的calpain活化:calpain(钙蛋白酶)是细胞质中另一半胱氨酸蛋白酶家族成员，其活化依赖于Ca2+的存在。在ERS时，细胞内Ca2+水平的升高引起细胞质calpain活化，剪切定位于ER膜上的procaspase-12，使之活化并释放入细胞质［15，16］。有证据表明，calpain的激活与很多疾病的形成有关，像缺血性脑损伤、阿尔茨海默病等。Nakagawa［15］研究发现，被剥夺氧和葡萄糖的神经胶质细胞会引起calpain和caspase-12的激活。应用calpain抑制剂后，caspase-12的切割被抑制，说明calpain激活了caspase-12。在皮质神经元细胞中也得到了相同结果。(2)TRAF2依赖性机制:在HEK293T细胞中已经证实，在非应激状态下，TRAF2与procaspase-12形成稳定的复合物，而ERS可导致procaspase-12与TRAF2分离，引起caspase-12活化，并同时引起JNK-IRE1复合物募集TRAF2，导致JNK磷酸化而活化［17］。神经元蜡样脂褐氏沉积病的CLN8(mnd)大鼠模型也证实了以上结果［18］。(3)caspase-7 ER转位:ERS引起caspase-7移位至内质网表面，与caspase-12形成复合物并在Asp94和Asp341处切割procaspase-12，破坏了膜与 caspase-12的联系，使之活化并释放于细胞质。caspase-12目前仅在鼠中得到克隆物，而人体中的caspase-12因为基因突变而丧失了调控凋亡的作用，但可能是其同源异构体caspase-4发挥相同作用。caspase-12的作用，目前的研究还不是很透彻。对caspase-12的了解，将对人类caspase-4的研究提供科学依据和借鉴。

2.4 GSK3/3β介导的凋亡通路 糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一种在进化上非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，主要有两种亚型，即GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β高度表达于中枢神经系统并具有神经系统特异性。GSK-3β能作用于众多信号蛋白、结构蛋白和转录因子，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡。GSK-3β在细胞内活性受双位点磷酸化调控，在Tyr216磷酸化激活，在Tyr216去磷酸化或者在Ser9磷酸化而失活。研究已经证实［19，20］，GSK-3β 与 ERS介导的神经细胞凋亡信号通路相关，使用GSK-3抑制剂可以减弱ERS介导的细胞凋亡，但GSK-3确切的促凋亡机制目前尚不完全清楚。Meares GP等人研究发现［21］，给予GSK-3抑制剂锂可以保护SH-SY5Y细胞及永生化大鼠海马神经元免受毒胡萝卜素、衣霉素和布雷菲德菌素A诱导的ERS。GSK-3抑制剂也可以保护小脑颗粒神经元免受布雷菲德菌素A诱导的ERS及其凋亡，保护SH-SY5Y细胞、PC12细胞、小脑颗粒神经元免受6-羟多巴胺诱导的ERS及凋亡，保护PC12细胞免受毒胡萝卜素诱导的ERS及凋亡。目前GSK-3抑制剂可能的保护机制包括抑制Bax的活化，上调GRP78和bcl-2的表达、降低细胞内钙水平和降低CHOP的表达。

2.5 内质网应激与线粒体 近年来研究证实，神经细胞凋亡机制中内质网与线粒体之间存在串扰［22，23］。线粒体外膜是位于线粒体最外围的一层单位膜，厚度约为6～7nm。高分辨三维X射线摄影可见内质网及线粒体之间有20%的膜是紧密接触的，在这些接触位点上线粒体外膜与内质网膜通过某些蛋白质相连，形成称为“线粒体结合内质网膜”(mitochondria-associated ER-membrane，MAM)的结构。该结构在脂质的相互交换和线粒体与内质网间的钙离子信号传导等过程中都有重要作用。长时间过强的ERS导致Ca2+从内质网腔内释放到MAM，进而引起线粒体基质摄取过量Ca2+。Ca2+的过量摄入会扰乱线粒体内的Ca2+稳态，持续的Ca2+聚积会导致线粒体通透性转化孔(mtPTP)的开放，促进CytC释放，激活caspase-9，进而激活下游caspases-3，引发死亡蛋白酶caspase级联反应，最后导致细胞凋亡。因此，ERS时可激活线粒体介导的凋亡通路，ERS是线粒体应激发生发展的始动环节。

3 结论与展望

内质网对于细胞正常功能的维持是必不可少的。ERS诱导的细胞凋亡广泛存在于神经系统疾病中，包括脑缺血性卒中、阿尔兹海默病、帕金森病等，所以内质网有望成为神经系统疾病治疗的新靶点。鉴于内质网应激时自我保护机制UPR的存在，提示人们基于这种分子机制和信号转导途径可能实现内质网应激诱发损伤的保护以及相关疾病的干预。Taurine(2-氨基乙磺酸)，抑制性神经递质，是广泛存在于哺乳动物中枢神经系统中的最多的游离氨基酸。近来，Gharibani等人的研究发现［24］，Taurine可以减弱低氧/复氧及缺血诱导的内质网应激，作用机制是阻断ATF6和IRE1通路活化，这在PC12细胞及大鼠MCAO模型中均得到证实。此外，基于内质网应激凋亡通路的相关分子可给予相应抑制剂进行阻断。Parecoxib，一种新的COX-2抑制剂，可以作为神经保护剂，挽救脑缺血再灌注损伤后内质网应激介导的神经细胞凋亡。近来，Ye Zhi等人发现［25］，Parecoxib可以显著抑制缺血半暗带CHOP的表达及caspase-12的免疫活性，进而减轻神经细胞凋亡。总之，内质网应激介导的神经细胞凋亡机制及其相关保护方案仍有待进一步研究，以帮助我们全面的深层次的了解内质网应激在神经细胞凋亡中的作用，并为临床疾病治疗方案提供坚实的理论基础。

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