任玉兰，弥春霞，张启律，游 佳，李晓玲

（牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江157011）

土茯苓，又名冷饭团、硬饭团、山牛、禹余粮、山遗粮、赤土茯苓、光叶菝葜等，为百合科多年生常绿攀缘状灌木，多生于山坡或林下，分布于我国安徽、浙江、江西、福建、湖南、湖北、广东、广西、四川、云南省等，是北方传统的清热解毒中药。土茯苓具有抗肿瘤、抗脂质过氧化、保护缺血心肌、免疫抑制、抗儿茶酚胺及抗动脉粥样硬化等药理作用，可用于治疗梅毒、淋浊、脚气、疔疮、冠心病、心绞痛、麻疹、急性细菌性痢疾和急慢性肾炎等［1］，对汞有一定解毒作用［2］，还具有增强机体免疫作用，其抗肿瘤作用与鞣质含量有密切关系［3］。

鞣质又称单宁或鞣酸，是存在于植物界的一类结构比较复杂的多元酚化合物，具有收敛、抗菌、抗病毒、解毒、降压、驱虫、清除体内自由基、抑制神经系统、降低血清中脲素氮含量、抗炎等多种功能。

目前，土茯苓生药学研究比较完善，但对土茯苓中有效成分的提取研究较少。鉴于此，作者通过单因素实验和正交实验对土茯苓中鞣质的提取工艺进行优化，拟为土茯苓的开发应用提供帮助。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

土茯苓：产自安徽，购于牡丹江市某药店。

丙酮、浓氨水、乙酸锌、氯化铵、乙二胺四乙酸钠、浓盐酸、铬黑T、冰乙酸、三乙醇胺、鞣质，均为分析纯。

SHB－3型循环水真空泵，郑州杜甫仪器厂；HS－11.6型电热恒温水浴锅，山西交水医疗器械厂；TB－214型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；RE－52A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 土茯苓中鞣质的提取流程

土茯苓干样→粉碎→称量→加入适量丙酮溶液→回流提取→减压过滤（取滤液）→减压蒸馏→含量测定。

1.3 提取工艺的优化

固定其它条件，分别考察丙酮浓度、料液比、提取温度、提取时间对鞣质提取量的影响；然后在单因素实验的基础上，选择提取温度、丙酮浓度、料液比、提取时间为考察因素，以鞣质提取量为考核指标，进行正交实验，以优化土茯苓中鞣质的提取工艺。

1.4 鞣质提取量的测定［4，5］

用移液管准确移取20.00mL 1mol·L－1的乙酸锌溶液于500mL容量瓶中，加入14mL饱和氨水，摇匀使白色沉淀完全溶解；将经回流提取的鞣质水溶液加蒸馏水稀释到400mL，于水浴锅中加热至（35±2）℃，然后定量移入该容量瓶中，并不断振摇，再置于恒温水浴锅中（35±2）℃温热约30min（间歇振摇数次），取出，冷却至室温，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用干滤纸过滤。

精密吸取滤液25.00mL于500mL锥形瓶中，加蒸馏水300mL、氨－氯化铵缓冲溶液（pH＝10）25mL、铬黑T指示剂少许，摇匀后用浓度为0.05mol·L－1的EDTA标准溶液滴定，当溶液由紫红色变为蓝色即为滴定终点，用空白校正。按下式计算鞣质提取量（mg·g－1）：

式中：0.1556为每毫升1mol·mL－1的乙酸锌溶液平均消耗鞣质0.1556g；V0为空白对照消耗EDTA标准溶液的体积，mL；V为样品消耗EDTA标准溶液的体积，mL；cEDTA为EDTA标准溶液的浓度，mol·L－1；m为土茯苓样品质量，g。

2 结果与讨论

2.1 土茯苓中鞣质的定性实验

将提取液分别与稀盐酸、溴水、三氯化铁、石灰水、乙酸铅、甲酸和香草醛等在试管中进行定性反应，结果见表1。

表1 土茯苓中鞣质的定性实验结果Tab.1 Qualitative experiment results of tannin fromSmilax glabra Roxb.

鞣质可分为水解鞣质和缩合鞣质。由表1可知，土茯苓中含有鞣质，且基本为水解鞣质。

2.2 单因素实验

2.2.1 丙酮浓度对鞣质提取量的影响（图1）

图1 丙酮浓度对鞣质提取量的影响Fig.1 Effect of acetone concentration on tannin extract

由图1可知，随着丙酮浓度的增加，鞣质提取量先升高后降低，当丙酮浓度为50%时，鞣质提取量达到最大。因此，选择丙酮浓度为40%、50%、60%进行正交实验。

2.2.2 料液比对鞣质提取量的影响（图2）

由图2可以看出，随着料液比的减小（即丙酮溶液用量的增大），鞣质提取量先升高后降低，当料液比为1∶20（g∶mL，下同）时，鞣质提取量达到最大。因此，选择料液比为1∶10、1∶15、1∶20进行正交实验。

2.2.3 提取温度对鞣质提取量的影响（图3）

图2 料液比对鞣质提取量的影响Fig.2 Effect of solid－liquid ratio on tannin extract

图3 提取温度对鞣质提取量的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on tannin extract

由图3可以看出，随着提取温度的升高，鞣质提取量先升高后降低，当提取温度为60℃时，鞣质提取量达到最大。因此，选择提取温度为50℃、60℃、70℃进行正交实验。

2.2.4 提取时间对鞣质提取量的影响（图4）

图4 提取时间对鞣质提取量的影响Fig.4 Effect of extraction time on tannin extract

由图4可以看出，随着提取时间的延长，鞣质提取量先升高后降低，当提取时间为90min时，鞣质提取量达到最大。因此，选择提取时间为60min、90min、120min进行正交实验。

2.3 正交实验

根据单因素实验结果，选择提取温度、丙酮浓度、料液比、提取时间为考察因素，以鞣质提取量为考核指标，进行L9（34）正交实验，以优化提取工艺。正交实验的因素与水平见表2，结果与分析见表3。

表2 正交实验因素与水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 L9（34）正交实验结果与分析Tab.3 Result and analysis of L9（34）orthogonal experiment

由表3可知，各因素对土茯苓鞣质提取量的影响大小依次为：提取温度＞料液比＞提取时间＞丙酮浓度，即影响最大的因素是提取温度，影响最小的是丙酮浓度。土茯苓的最佳提取条件为A3B1C2D2，即提取温度70℃、丙酮浓度40%、料液比1∶15（g∶mL）、提取时间90min。

2.4 精密度实验与加标回收率实验

称取10g土茯苓于5个250mL圆底烧瓶中，加入40%的丙酮水溶液150mL，于70℃回流提取90 min，抽滤后测定滤液中鞣质提取量。结果见表4。

称取10g土茯苓于5个250mL圆底烧瓶中，向各烧瓶中加入1mL鞣质标液，再加入40%的丙酮水溶液150mL，于70℃回流提取90min，抽滤后测定滤液中鞣质提取量。结果见表4。

表4 精密度实验与加标回收率实验结果Tab.4 Results of the precision experiment and the standard addition recovery experiment

由表4可以看出，在优化的提取工艺条件下，土茯苓中鞣质的提取量为20.77mg·g－1，回收率为99.90%，方法可靠，重现性好。

3 结论

通过单因素实验和正交实验确定土茯苓中鞣质的

最佳提取工艺为：提取温度70℃、丙酮浓度40%、料液比1∶15（g∶mL）、提取时间90min，在此条件下，土茯苓中鞣质提取量为20.77mg·g－1。该提取工艺经济可行，方法的精密度高、重现性好。

［1］张存莉，刘虎岐，傅建熙.药用植物土茯苓研究进展［J］.陕西林业科技，1999，（3）：60－63.

［2］徐笑飞，陈红风，叶媚娜.土茯苓解汞毒的研究概况［J］.中国中药杂志，2012，37（6）：750－753.

［3］张颖，张立木，丁静，等.土茯苓中单宁含量的测定［J］.泰山医学院学报，2004，25（3）：212－213.

［4］王家栋，于兴博.正交实验法优选榛子叶中鞣质的超声提取工艺［J］.黑龙江医药，2009，22（3）：313－314.

［5］马彦梅，龚晓武，李炳奇.正交试验优化沙枣果肉中鞣质的超声提取研究［J］.食品研究与开发，2012，33（2）：58－60.