孔宏亮 苗志林 李占全 叶丽萍

（辽宁省人民医院心脏中心 沈阳110016）

阿霉素（adriamycin，Adr）的高效、广谱抗肿瘤特性使其被广泛应用于治疗多种恶性肿瘤，不过，其导致不可逆心肌病、心力衰竭（heart failure，HF）的心脏毒性却严重限制其在临床上的应用，并因此成为HF模型构建的经典方法之一。目前认为细胞凋亡在Adr心肌毒性中发挥重要作用，可能涉及线粒体途径、Fas途径、PI3K／Akt途径、神经酰胺信号系统、P38MAPK途径、P53途径、P35途径和GATA－4途径等的相互作用［1，2］。具有内源性整合调控机制的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在适度表达时可调节细胞自稳态而抑制凋亡，但持续过度的 ERS却触发细胞凋亡［3－5］。

在 ERS 中，肌 醇 依 赖 酶 1（inositol－requiring enzyme，IRE 1）通路起着重要作［5－7］，在IRE1启动细胞凋亡中，最显著的就是c－Jun N末端激酶（JNK）途径［5－7］：IRE1 激 活 后，通 过 TNF 受 体 相 关 因 子 2（tumor necrosis factor receptor－associated receptor 2，TRAF2）－凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal－regulating kinase 1，ASK1）－c－Jun N末端激酶（c－Jun N－termianl kinase，JNK）途径激活JNK，诱导细胞凋亡。目前，对于Adr致心肌损伤效应中，ERS所发挥的作用罕见报道，更遑论Adr对IRE1－TRAF2－ASK1－JNK通路的影响。

材料和方法

1.动物和试剂

Wistar大鼠（150－200g）和乳鼠（1－3d）源自中国医科大学动物中心［SCXK（辽）2003－0009］。试剂：阿霉素（adriamycin，Adr；Sigma公司），总Rt－PCR提取试剂盒、Rt－PCR逆转录试剂盒和Rt－PCR引物（武汉博士德生物技术公司），FCM试剂盒（Sigma），即用型兔抗大鼠IRE、X盒结合蛋白1（X box－binding protein l，XBP l）、TRAF2、ASK1、JNK1／2和 GAPDH 兔抗鼠多克隆抗体及羊抗兔Ig G等（宝生物工程大连有限公司）等。

2.Adr构建HF模型

参照文献 构 建 HF 模 型［3，4，9］，方 法 如 下：随 机取健康大鼠分为Adr组 （n＝15）和对照组（control group，n＝10）；Adr组腹部注射 Adr（2 mg／kg），每三天一次共连续五次，之后每周一次共五次，停用2周后心脏超声检查确认HF模型成功构建；对照组按Adr注射方法注射等量生理盐水。所有大鼠均常规喂养。

3.心脏超声检查

按下述方法对大鼠行心脏超声检查［1，2，8］：腹部注射10%水合氯醛 （0.3－0.4mg／l00g）15－20min后仰卧位固定，重复3次测定左室射血分数（LVEF）并取其均值，LVEF＜45%被作为HF标准。

4.心肌细胞培养和干预

根据文献选择培养乳鼠心肌细胞，方法如下［10－14］：取心脏左室并剪碎，予0.08%胰蛋白酶振荡、消化（37℃）后离心细胞悬液 （－4℃，100 g，10 min），移沉淀物入培养皿，差速贴壁法获取心肌细胞并接种于培养瓶，隔2天全量换含15%FBS的H－DMEM营养液；将心肌细胞随机分为对照组和Adr组（1μmol／L），干预前24 h各组均 换 为L－DMEM （含15%FBS），干预时培养液中无FBS，干预时间均为96 h。

5.FCM 分析细胞凋亡率（Apoptosis Rate，AR）

将培养的两组乳鼠心肌细胞消化、洗涤后并调整每样本细胞数为1×106／m L，根据试剂盒说明书行FCM，激发光波长488 nm，用515 nm波长检测FITC荧光、560nm波长检测PI荧光，以二维点阵图显示并记录凋亡细胞百分比。在FCM双变量散点图上，左下象限为活细胞（FITC－／PI－），右下象限为凋亡细胞（FITC＋／PI－）。每样本至少检测三次，取其均值。

6.Western blot检测

提取心肌总蛋白后将其调至同一浓度，完成聚丙烯酰胺凝胶电泳（每孔加样20μl）、转膜、封闭后，分别加入IRE 1、XBP l、TRAF 2、ASK1、p－ASK1、JNK1／2、p－JNK1／2和 GAPDH 一抗（均1∶200稀释），4℃孵育过夜，于洗膜后加入二抗（1∶400）孵育1h，完成后采用自动凝胶成像分析系统计算积分光密度（IOD），将其IOD分别与内参IOD比值作为相应蛋白半定量指标。每样本至少检测三次并取其均值。

7.统计学方法

采用SPSS 15.0软件包行统计学处理，计量资料以均值±标准差（±s）表示，用One－way方差（One－way ANOVN）进行统计学分析，P＜0.05具有统计学意义。

结 果

1.Adr损伤心肌

在体研究显示Adr组LVEF显著低于对照组（0.53±0.03 vs 0.41±0.02%；图1）。体外研究显示阿霉素组心肌细胞凋亡率显著高于对照组（23.3±4.0%vs 5.7±2.1%，P＝0.003；图2）。

2.Adr对IRE1α的影响（图3）

Adr构建的HF大鼠心肌组织中IRE1α和p－IRE1α水平均显著高于对照组（P＝0.000），分别是对照组的4.42±0.35和3.47±0.20倍；与在体研究相似，Adr干预的心肌细胞亦显著提高IRE1α和p－IRE1α的表达（P＝0.000），分别是对照组的5.41±0.27和4.91±0.45倍。

图1 在体研究的各组LVEF。1：对照组，2：Adr组图2 体外研究的各组心肌细胞AR。1：对照组，2：Adr组图3 Western blot检测IRE1α和p－IRE1α蛋白的表达。1：对照组，2：Adr组Fig.1 The mean± SD of LVEF in each group，in vivo.1：control group，2：Adr groupFig.2 AR of cardiomyocytes in each group，in vitro.1：control group，2：Adr groupFig.3 protein assay in each group by western blot.1：control group，2：Adr group

3.Adr对XBP l的影响（图4、图5）

与相应对照组相比，体内（4.40±0.13倍，P＝0.000））、体外（4.51±0.12倍，P＝0.000）Adr组XBP l蛋白的表达均显著升高。

4.Adr对TRAF 2的影响（图4、图5）

体内和体外Adr组TRAF 2蛋白均显著高于相应对照组（P＜0.001），分别是对照组的5.91±0.22和4.45±0.05倍。

图4 Western blot检测各组蛋白的表达1和2分别代表对照组和Adr组图5 各组蛋白表达直方图 分组内的1和2分别代表对照组和Adr组；X轴上1、2、3、4、5、6分别代表XBP l、TRAF 2、ASK1、p－ASK1、JNK1／2和p－JNK1／2；1和2分别代表体内和体外Fig.4 protein assay in each group by western blot 1 and 2 represents control group and Adr group，respectivelyFig.5 histogram of protein in each group 1 and 2，in each group，represents control group and Adr group，respectively；1，2，3，4，5 and 6，in X axis，represents XBP l，TRAF 2，ASK1，p－ASK1，JNK1／2 and p－JNK1／2，respectively；1 and 2 represents in vivo and ex vivo，respectively

5.Adr对ASK1的影响（图4，5）

Adr构建的HF大鼠心肌组织中总ASK1和p－ASK1水平显著高于对照组（P＜0.001），分别是对照组的2.79±0.11倍和3.44±0.10倍；Adr干预的心肌细胞亦显著上调总ASK1和p－ASK1的表达（P＝0.000），分别是对照组的2.67±0.15倍和3.25±0.12倍。尤为重要的是，Adr组ASK1磷酸化水平（即p－ASK1与总ASK1比值）显著上调（P＝0.000），体内、体外分别是对照组1.46±0.11倍和1.24±0.10倍。

6.Adr对JNK1／2的影响（图4，5）

不管在体内或在体外，Adr组JNK1／2、p－JNK1／2蛋白和其磷酸化水平（即p－JNK1／2与总JNK1／2比值）均显著高于相应对照组（P＝0.000），体内分别是对照组的2.16±0.09倍、3.14±0.15倍和1.45±0.21倍，体外分别是对照组的2.03±0.06倍、3.23±0.11倍和1.58±0.15倍。

讨 论

Adr致HF等的心脏毒性使其成为构建HF模型的经典方法，不过，关于其毒性的确切机制并不清楚，虽然目前认为Adr致HF的机制涉及到多个方面［1，2］，但对其在ERS方面的研究罕见报道。诚然，ERS中的IRE1通路失衡在促进HF进程中起着重要作用［3－5］，但ERS中的IRE1通路是否介导其毒性并不清楚，因此，本研究从IRE1－ASK1－JNK通路方面探讨Adr介导HF毒性的机制。

IRE1位于内质网膜，是一个跨膜丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，非应激状态下，IRE1与GRP78等分子伴侣结合成稳定复合物而不被激活；应激时，IRE1与GRP78等分子伴侣被动解离，自发寡聚化和反式自磷酸化，继而激活其梭基端的核糖核酸内切酶域而具有核酸内切酶活性［12，13］。本研究显示Adr致HF及致体外培养的心肌细胞损伤时大量表达IRE1α和促进其磷酸化，提示IRE1α的表达和磷酸化独立于HF之外，另外亦提示IRE1α过表达可能系细胞损伤的一个标记［14］和IRE1－ASK1－JNK通路的始动环节。Adr致IRE1表达和磷酸化可能系心肌细胞应激时IRE1与GRP78等分子伴侣分离并自磷酸化有关，但IRE1是否通过翻译增加其表达以及是否通过其他方式激活等仍待探讨。

IRE1通过剪切编码XBP1 mRNA翻译生成XBP1，具有活性的XBP1转位至细胞核后上调ERS相关基因的表达，研究表明缺氧可促使乳鼠心肌细胞表 达 XBP1［15］，XBP1 适 度 表 达 可 通 过 上 调GRP78而增强内质网处理未折叠蛋白能力，但其过度持续表达却促发细胞凋亡。本研究证实Adr致心肌损伤同时伴有XBP1蛋白表达的上调，提示其可能与Adr毒性效应相关，但其如何介导IRE1－ASK1－JNK通路并不明确。可溶性蛋白TRAF2存在于胞浆内，是将信号从内质网传向胞浆的关键介质，具有抗凋亡和促凋亡双重效应。本实验发现Adr在致心肌损伤过程中上调IRE1和TRAF2表达，此提示IRE1－TRAF2信号通路被激活并参与内质网细胞凋亡反应［14］。

活化的IRE1和TRAF2进一步激活ASK1－JNK途径，而ASK1的激活可促进心肌细胞凋亡（包括非凋亡性细胞死亡）、心肌再灌注损害和心肌病，同时可激活JNK1／2［16，17］。本研究显示 Adr既可在体内又可在体外促发ASK1、p－ASK1的表达甚至促进其磷酸化水平，此无疑提示Adr的心肌毒性可直接通过其提高ASK1的表达和磷酸化水平实现。JNK信号通路是通过ERS介导细胞凋亡的重要信号通路，研究证明Adr干预显著升高JNK表达和其磷酸化水平，敲出JNK基因或抑制JNK表达可减轻心肌细胞凋亡和改善心功能［18，19］，本研究进一步证实Adr可独立于HF促发心肌表达JNK和促进其磷酸化水平。

总之，本研究在进一步证实阿霉素心肌毒性基础上，较为系统的探讨了Adr通过IRE1－ASK1－JNK通路致心肌损害的机制，最终显示Adr通过上调和磷酸化IRE1α、提高XBP l和TRAF 2表达等进一步上调ASK1、JNK1／2蛋白和其磷酸化水平，从而导致HF的发生、发展；另外，不管是体内或体外，各个因子的蛋白水平表达均一致等更进一步证实Adr致HF中的IRE1－ASK1－JNK通路独立于HF之外。

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