孙全新 孙小蓉 吴文竹

（武汉市中山医院肿瘤科 湖北430033；1武汉市东湖医院 湖北430074）

宫颈癌是由高危型HPV病毒持续感染所致。HPV病毒可整合到宫颈细胞DNA中，通过病毒E6或E7蛋白影响p Rb或P53通道［1］，引起宫颈细胞核内染色体倍体改变，例如HPV16型病毒可致细胞核内染色体3q增多，最终可致宫颈癌［2－3］。最近，很多研究测定宫颈细胞内Ki67和P16蛋白，用于检验高危型HPV感染引起宫颈细胞异常增生［4－5］。Ki67蛋白表示细胞正在增生状态［6］，而P16蛋白表示为高危型 HPV感染［7］。很少有人研究Ki67和P16双阳性细胞是否出现在异倍体细胞，本文试图用图像分析仪结合Ki67和P16免疫荧光方法，证实同一个异倍体细胞内Ki67和P16的表达。

材料和方法

1.标本来源

2012年3月，8例妇女（37±6岁）做宫颈细胞学检查和宫颈组织学活检。宫颈细胞检查试剂盒由武汉兰丁医学高科技有限公司提供，其中包括：宫颈刷、盛有固定液的标本管、标签等。

2.宫颈细胞液基薄层制片及染色

取样方法按常规方法进行取材。用于液基薄层制片试剂盒由武汉兰丁医学高科技有限公司提供，其制片染色方法按常规方法进行。DABI试剂来自于武汉博士德公司，单克隆Ki67和单克隆P16抗体来自于上海上岛生物工程科技公司，分别用荧光FITC和TRITC标记的二抗。Ki67阳性为核内绿色，而P16阳性为核胞浆红色。用PBS代替一抗作为阴性对照。

3.DNA倍体分析方法

所有DABI染色片采用兰丁全自动细胞图像分析系统进行扫描处理（武汉兰丁医学高科技有限公司）。该系统用OLYMPUS荧光显微镜在紫外光下对每张玻片中1000个以上的细胞核进行扫描测定细胞核为浅蓝色。经扫描后的每个细胞核均有77个特征值，其中包括形态特征、吸光特征、具体结构特征等。系统根据不同细胞成分所具有的不同特征参数来完成自动细胞分类和计数过程。标准对照细胞为同张玻片上的100个正常上皮细胞，所测出的平均光密度（Integrated Optical Density IOD）为2c的参考值，其CV（Coefficient of Variation）值小于5% 。凡是有大于5c以上非整倍体细胞，都要通过细胞技术员在显微镜下逐一对大于5c细胞进行核实。

4.组织病理学检查

在8例宫颈活检中发现2例宫颈炎，1例CIN1，2例CIN2，2例CIN3和一例宫颈浸润癌。CIN2，CIN3和浸润癌为高级别宫颈病变，宫颈炎和CIN1为低级别宫颈病变。

结 果

1.细胞周期内DNA倍体变化和Ki67表达

在8例宫颈细胞样本中除第5例，第7例和第8例外，S期内只有少数细胞。每例均可见细胞出现在G2期。S期和G2期Ki67阳性细胞数约占S－G2期91%左右。每例样本上皮细胞大多处于G0／G1期，Ki67阳性细胞数平均≤1.5%。

2.异倍体细胞内DNA倍体，Ki67和P16表达

2例宫颈炎的细胞样本中均未见＞5c的异倍体细胞。1例CIN1标本中有4个＞5c的异倍体的细胞数，但Ki67和P16均阴性。后五例包括2例CIN2，2例CIN3和1例浸润癌，均可见＞5c的异倍体细胞，5例中＞5c的异倍体细胞总数为55，其中Ki67阳性细胞为38，占69%（38／55）；P16只在3例中有表达，阳性细胞数为12，占＞5c的异倍体细胞的21.8%（12／55）；Ki67和P16共同阳性细胞数为10个，占＞5c的异倍体细胞的18.2%。P16阳性细胞数占Ki67阳性细胞数的31.6%（12／38），表1、图1和图2。

表1 8例宫颈细胞中异倍体细胞及其Ki67和P16阳性细胞数Table 1 Number of aneuploid cells，ki67 positive and p16 positive cells in 8 cervical cases

讨 论

1.异倍体细胞Ki67和P16蛋白表达

很多作者用流式细胞仪测定异倍体细胞Ki67蛋白表达。本文通过DABI荧光染色宫颈细胞测定其细胞核内倍体状态，再通过Ki67和P16免疫荧光着色细胞，通过三种不同激发光分别测定同一个细胞内DNA含量、Ki67和P16蛋白表达。若异倍体细胞有Ki67和P16阳性，分别提示此宫颈细胞被HPV病毒感染导致细胞内染色体倍数改变和细胞呈现增殖状态。异倍体细胞若Ki67表达阴性，虽无详细报道，是否说明异倍体细胞呈现在静止状态。异倍体细胞P16蛋白表达阴性或许说明这类异倍体细胞的产生与高危型HPV无关。

2.异倍体细胞Ki67阳性表示细胞正在处于增殖周期中

Ki67是细胞进行增殖周期时的蛋白表达，表示细胞正处于细胞有丝分裂状态，在正常细胞分裂周期中，除G0期外，G1、S1、G2期细胞核内均可见Ki67蛋白表达。G0／G1和G2期细胞DNA倍体分别为2c和4c；S期DNA倍体在2c与4c之间。本文所示＞5c的异倍体细胞均在正常细胞周期之外，说明细胞DNA倍体已经发生异常改变。异倍体细胞如何进行增殖仍不清楚。但当异倍体细胞中出现Ki67蛋白阳性时，表示异倍体细胞正在增生分裂状态。本文中69%的异倍体细胞Ki67阳性，说明这些宫颈细胞正在增殖发展中。

3.异倍体细胞内Ki67和P16阳性表达提示病变严重程度

异倍体细胞中P16阳性表示这些异倍体细胞是由HPV病毒感染所致。P16INK4a是cyclin－dependent kinaze（CDK）抑制因子，它可减慢细胞增殖速度。HPV整合到人类基因后可产生E6，E7病毒蛋白。E7 HPV蛋白可促使retinolastoma protein（p Rb）和E2F形成复合体。E2F增多可增强P16INK4a活性及表达［8］。有研究证实80%以上高级别宫颈病变（CIN2，CIN3和浸润癌）的宫颈组织中P16蛋白的表达阳性而宫颈炎和CIN1病变的阳性表达率不到31%。同时P16蛋白的表达提示高危型HPV感染及宫颈病变的严重阶段［6］。本文证实在5例CIN2以上病变中有3例P16为阳性。以往很少有人证实Ki67和P16蛋白在同一细胞中表达。本文证实在＞5c异倍体细胞中有18.2%细胞中同时表达Ki67和P16。

总之，宫颈异倍体细胞中大多为Ki67表达阳性，说明异倍体细胞呈增生状态。少数异倍细胞呈现Ki67和P16共同阳性，说明这些细胞是由HPV病毒引起的细胞染色体的异常，病变正往恶性方向发展。

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