陈圣林 ，王会娜 ，孙 颖 ，陈 显 ，李建安

(1.中国林业产业联合会，北京 100714；2.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004)

三峡库区14个李品种遗传多样性的ISSR分析

陈圣林1，王会娜2，孙 颖2，陈 显2，李建安2

(1.中国林业产业联合会，北京 100714；2.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004)

以湖北省秭归县三峡库区的14个李品种为研究材料，根据优化的ISSR-PCR反应体系，从24条引物中筛选出10条扩增条带特异性好、条带数目适中、条带清晰、重复性好的引物，总共扩增出101条清晰可重复的DNA条带，其中83条为多态性条带，多态带百分率为82.18%，每个引物扩增的条带大小在300～3000 bp之间，数目在8～12条之间，平均为10.1条。应用软件POPGENE 1.31和NTSYS-pc对所得数据进行分析处理，从而得出14个李品种的遗传相似系数和遗传遗传距离，并绘制出品种相似性的UPGMA聚类图和主坐标分析的二维、三维散点图，结果表明:遗传一致度的变化范围在0.6022～0.8636之间，遗传距离的变化范围在0.146 7～0.507 2之间。根据品种相似性的聚类图和主坐标分析图，可将14个李品种分为3大类:美国布朗李系列品种、中国李系列品种以及介于两者之间的杂合种，其中杂合种与中国李系列品种的遗传相似性更高。

李；遗传多样性；遗传距离；ISSR；PCR

李树属蔷薇科Rosaceae李属PrunusL植物，该属大约有30余个种或变种[1]。李按其起源中心可分为3个系：①东亚系，主要有中国李、乌苏里李、杏李等；②欧亚系，主要有欧洲李、樱桃李、黑刺李、乌荆子李；③北美系，主要有美洲李、加拿大李、果酱李、天鹅李、狭叶李、亚心形李或太平洋李。李是我国栽培历史悠久的果树树种。据考古学研究证明，远在5 000乃至6 000年前，我国的祖先己经采食李的果实，用以充饥，有记载的栽培历史在3500年以上[2]。到目前为止，我国李由8个种5个变种800余个品种及类型，①中国李，其变种有毛梗李、柰李；②杏李；③乌苏里李；④樱桃李，其变种有紫叶李；⑤欧洲李；⑥美洲李；⑦黑刺李；⑧加拿大李[3]。

李树树种之间容易杂交培育出超过亲本的杂交种，并容易培育出优良无性系进行无性繁殖，特别是从20世纪60年代开始，我国引进了很多国外李品种，在选出适宜的品种后，进行种源和家系的筛选，然后选出优良单株进行无性繁殖，同时对不同种的优良单株进行杂交育种，选出超出亲本的优良杂交种进行栽植推广，造成我国现有李品种种源关系较为混乱，品种良莠不齐，不利于我国李产业的发展。因而，有必要对我国的李树品种间进行分子水平上的遗传多样性分析，为建立李树种植资源库打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

该实验材料来自湖北省秭归县三峡库区的14个李品种（见表1），于2009年10月采集各品种的新叶带回实验室，并保存与-70 ℃冰箱中备用。

1.2 引物序列及合成

该研究所用的引物为参照有关文献[4-7]，从哥伦比亚大学(UBC)设计的100条引物中筛选出24条引物序列，由上海博尚生物技术有限公司合成。

1.3 李树基因组DNA的提取

该实验采用试剂盒法提取李树叶片中的基因组DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，用核酸蛋白质分析仪测定OD260和OD280的值[8]，计算其浓度。

1.4 ISSR-PCR体系及引物的筛选

采用优化的ISSR-PCR反应体系为:20 μL的反应体系中，10×Buffer(Mg2+free)2.0 μL，1.5 U Tap DNA 聚合酶，0.5 μmol/L 的引物，0.2mmol/L的dNTPs，20 ng 模板DNA。最佳PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94℃变性45 s；56℃退火1min；72℃延伸10 min；39个循环，72℃延伸10 min，最后16 ℃保存10 min。

利用该体系，随即筛选出3个种源在24条引物中筛选出适合14个李品种ISSR-PCR扩增、扩增条带清晰且多态性好的引物，然后再分别用不同的引物对14个李品种的基因组DNA进行全面扩增，每个引物重复3次，以保证实验结果的可靠性。

2 结果与分析

2.1 李树基因组DNA的提取及质量检测

采用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取14个李品种的基因组DNA，通过纯化后最终用TE缓冲液定容至100 μL，并用0.8琼脂糖凝胶电泳检测(见图1)。结果表明，所提取的DNA条带清晰，无明显的拖带现象，提取效果较好。通过核酸蛋白分析仪测定分析，所提取的基因组DNA的纯度R(OD260/OD280)值在1.7～1.8之间，表明所提样品中RNA与蛋白质的含量较少，可以满足PCR扩增的要求。

表1 李树14个品种名称及样品编号Table 1Number and name of 14 Prunus

图1 李树14个样品的基因组DNA电泳图像Fig.1Electrophoresis pattern of genomic DNA from 14 species of Prunus

2.2 李树ISSR-PCR扩增结果

利用已经优化的李树ISSR-PCR反应体系，对24条引物进行筛选，获得10条适合14个李品种的ISSR扩增反应的引物(见表2)，该10条引物的扩增条带特异、条带数适中、清晰、可重复性好(见图2)。

表2 李树14个样品的ISSR扩增引物及获得的条带数Table 2Primers used for ISSR-PCR on 14 Prunus samples and band numbers of per primer

图2 引物UBC 857对李树14个样品的ISSR-PCR扩增电泳图像Fig.2PCR result of 14 Prunus samples by ISSR

10条引物对全部14个李品种扩增，共扩增出101条清晰且可重复的DNA条带，其中有83条属多态带，每个引物所扩增出来的DNA条带数目不等，在8～13条之间，平均为10.1条，总多态百分率为82.18%，其中引物UBC866扩增的多态带百分率最高，为100%(见表2)。10条引物所扩增的DNA片段的大小范围在300～3000 bp，完全符合分子标记对扩增条带的要求。

2.3 李树的遗传距离与遗传一致度的分析

遗传距离（genetic distance）和遗传一致度（genetic identity）是用来衡量两个物种之间遗传分化程度的重要指标。本实验采用Nei’s遗传距离和遗传一致度，并应用POPGENE 1.31分析软件对14个李品种进行分析（见表3）。表2表明，14个李品种中，遗传距离的变化范围在0.146 7～0.507 2之间，遗传一致度的变化范围在0.6022～0.860 1之间。青皮麦李和红皮麦李遗传距离最小，为0.146 7，同时相应的遗传一致度最高，为0.8636；空心李和红皮麦李具有最大的遗传距离，为0.507 2，相应的其遗传一致度也最低，为0.6022。

2.4 李树14个品种的亲缘关系聚类分析

本实验应用NTSYS-pc软件对14个李品种进行UPGMA聚类分析(见图3)[9]。图3表明，14个李品种之间的亲缘关系为:秭秋、秭露、秋露、梅李女皇之间的亲缘关系较近，可聚为一组；变异株、黒霸、空心李、谷李、紫琥珀、早美丽、青皮麦李、大红玫瑰、艳红、红皮麦李之间的亲缘关系较近，聚为第二组。第二组中变异株和黒霸的亲缘关系较近，空心李、谷李、早美丽、大红玫瑰、艳红之间的亲缘关系较近，青皮麦李和红皮麦李之间的亲缘关系较近，紫琥珀与其他品种亲缘关系均较远。11和14两个品种间的遗传相似性最近，既表明其亲缘关系最近，与POPGENE 1.31软件进行分析是结果一致。

表3 李树14个品种间的遗传一致度(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)Table 3Nei’s original measures of genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)among 14 samples of Prunus

图3 李树14样品相似性的UPGMA聚类图像Fig.3UPGMA dendrogram of genetic similarity among 14 samples of Prunus

2.5 李树14个品种遗传分化的主坐标分析

主坐标分析（Principal Coordinates Analysis）以品种间的相似性系数矩阵为基础，建立新的坐标系，不同品种在主坐标图中的位置能反映出它们之间的亲缘关系。品种间位置越接近，表明它们的遗传相似性越大，亲缘关系越近，反之，则表明其遗传差异越大，亲缘关系越远[9]。本实验在聚类分析的基础上，应用NTSYS-pc软件对14个李品种进行主坐标分析，分别建立14个李品种的主坐标二维散点图（见图4）和主坐标三维散点图（见图5）。

图4 李品种资源主坐标分析二维散点图像Fig.4 Two-dimensions scatter-graph of Prunus species by principal coordinate analysis

图5 李品种资源主坐标分析三维散点图像Fig.5 Three-dimensions scatter-graph of Prunus species by principal coordinate analysis

从主坐标二维散点图和三维散点图可以看出，秭秋、秭露、秋露、梅李女皇亲缘关系较近，可聚为一类；其它可聚为第二类，其中青皮麦李和红皮麦李亲缘关系最近，与POPGENG软件分析得出的遗传距离与遗传一致度关系基本一致。

3 结论与讨论

采用优化的ISSR-PCR反应体系，对李树的14个品种进行了扩增，从24条引物中挑选出10条重复性好、条带特异、多态性明显且条带清晰的引物。该10条引物对对14个品种分别扩增出101条清晰可重复的DNA条带，其中有83条属于多态带，平均每条引物为8.3条多态带，各引物的多态百分率在63.6%～100%之间，平均为82.18%，其中扩增条带长度在300～3000 bp之间。通过POPGENE 1.31软件对数据进行处理分析得出，14个李品种的Nei’s遗传距离的变化范围在0.146 7～0.507 2之间，遗传一致度的变化范围在0.6022～0.860 1之间。

利用NTSYS-pc软件对14个李品种进行分析，得出14个品种的相似性UPGAM聚类图和主坐标分析二维、三维散点图，结果表明：14个品种中秭秋、秭露、秋露、梅李女皇4个李品种与其余10个李品种间遗传分化较为明显，遗传多样性较高，而该4个李品种间相似性较高，遗传分化程度相对较小。该4个品种中秭秋、秭露、秋露是由布朗李系列品种中的佛莱索、秋姬、安哥诺引种驯化而来，而梅李女皇亦是由60年代由美国引进的布朗李系列品种。红皮麦李、青皮麦李、空心李、谷李、红心李、密斯、黑霸、紫琥珀、早美丽、大红玫瑰10个品种遗传相似性较高，其中红皮麦李、青皮麦李、空心李、谷李、红心李为中国李品种，密斯李未中国李与樱桃李的杂交种，紫琥珀、早美丽、大红玫瑰为中国李与美国李的杂交种，其中杂交种的亲缘关系与中国李更为接近，同时反映出李不同种源间具有较高的遗传多样性水平，这与其分布范围广泛有关。

ISSR分 子 标 记 技 术 与ALFP、RLFE、RAPD、SSR等分子标记技术相比，具有可重复性高、多态性位点丰富、技术难度低、操作性强等优点，因而被广泛应用于品种间的遗传多样性分析、品种鉴定等分子研究方面的分子标记技术，然而，实验中发现ISSR分子标记技术也存在一些问题，例如Tap酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度、退火温度等条件对ISSR-PCR的影响较大，条件不适宜可能造成非特异性条带较多、拖带严重等现象[10-11]。同时部分条带较弱，在进行遗传多样性分析时，这些弱带是否被统计在内，没有一定的标准，主观性较强，这就使遗传多样性分析、遗传图谱建立和品种鉴定等结果出现不稳定性， 这些弱带的原因可能是由于存在其他一些较亮的条带，从而抑制了这些弱带的扩增或随机引物在此结合位点的结合率较低等[12]。因此，针对这些问题，我们还需要在以后的试验中继续探讨，以促进ISSR分子标记技术的成熟。

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ISSR analysis on genetic diversity of fourteen Prunus varieties in three gorges reservoir area

CHEN Sheng-lin1,WANG Hui-na2,SUN Ying2,CHEN Xian2,LIJian-an2
(1.Chinese Forestry Industry Association, Beijing 100714, China; 2.Central South University of Technology & Forestry, Changsha 410004, Hunan, China)

The 14Prunussamples from Zigui county, Hubei province, were used as the materials to analyze their genetic diversity.According to the improved ISSR-PCR reaction system and amplification condition, 10 primers were selected out from 24 random primers which can yield specific bands with moderate band numbers, clear background and well reproducibility. Total 101specific and reproducible DNA bands were obtained of which 83are polymorphic bands which polymorphism were 82.18%. Each primer can yield bands spanning 300～3000 bp and band number varies from 8 to 12(average 10.1). Biosofteares including POPGENE 1.31and NTSYS-pc were used to analyze the polymorphic bands obtained, and hence to yield the genetic similarity coeff i cient of the 14 samples and map the related graphics. The results show that the genetic identity varies between 0.6033～0.860 8, and the genetic distance varies between 0.146 7～0.507 2, and that the 14 samples ofPrunuscan be divided into three groups: the fi rst wasPrunus AmericanaMarsh,second wasPrunus salicina, the three was coeno-species. The higher genetic similarity was between coeno-species andPrunus salicina.

Prunus; genetic identity; genetic distance; ISSR; PCR

S794.4；S718.46

A

1673-923X(2012)09-0130-05

2012-08-15

林业公益行业科研专项经费项目(201104052);国务院三峡办移民科研项目(鄂移[2009]185)

陈圣林(1968-)，男，湖北天门人，工程师，博士，主要从事经济林栽培育种与产业开发工作

[本文编校:吴 毅]