何海旺 ，许春燕 ，李 文 ，李创珍 ，韦善清 ，何龙飞

（1.广西大学农学院，南宁 530005；2.广西农业科学院经济作物研究所，南宁 530007）

常规的甘蔗加繁，繁殖系数低，1年仅增加种量15～20倍，极大地限制了甘蔗新品种的迅速推广和应用[1]。利用甘蔗组培技术，实现工厂化育苗，已成为快速繁殖推广应用甘蔗良种的有效途径[2]。同时，甘蔗组培技术作为一种有效的脱毒技术[3-7]，它可以把蔗株上的花叶病、宿根矮化病等用常规方法难以防治的病害减弱，生产健康种苗用于生产，增产增糖效果明显。甘蔗品种“粤糖55号”是由广州甘蔗糖业研究所湛江甘蔗研究中心于2007年以粤农73-204为母本、CP72-1210为父本进行杂交选育而成的甘蔗新品种[8]。该品种属早中熟品种，萌芽快而整齐，萌芽率高，分蘖力强，前中期生长快，中后期生长稳健，植株高，中至中大茎，茎数多，粗生耐旱，抗风力较强，宿根发株早而多，宿根性强，可保留4～5年宿根。经试验，粤糖55号甘蔗11—12月平均含蔗糖分为15.23%，比ROCl0甘蔗品种高1.02%（绝对值，下同），比ROCl6甘蔗品种高0.57%[8]。粤糖55号适宜广东、广西、云南、海南等地力中等的旱坡地、山坡地或山地推广种植。2009年引种到广西大学农学院教学科研基地种植，生长表现良好，有良好的推广应用前景。本研究对甘蔗品种“粤糖55号”的离体快速繁殖技术进行了研究，旨在为生产该品种的健康种苗，加快该品种在广西推广应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以“粤糖55号”作为试验的品种，取生长至1m左右的甘蔗茎杆，将其切成长2cm、宽1cm、厚0.5cm带腋芽的小块作为外植体。

1.2 培养基及培养条件

实验用到的培养基的成分见表1，所有培养基的pH值均为5.8。所有材料接种后均置于实验室中进行培养，培养条件为：温度为28±2℃，光照强度为2000lx，每天光照12h。

2 实验结果

2.1 外植体的消毒及启动培养

将切好的外植体在自来水下冲洗10min，再用70%酒精浸泡30s，倒去酒精，加入0.1%HgCl2表面消毒7min后，用无菌水冲洗4次，将表面的HgCl2冲洗干净。消毒的外植体在启动培养基（表1）上培养7d后，调查其污染率。在本实验中，接种的外植体个数为96，其中有34个外植体被污染，污染率为35.4%。

外植体在启动培养基上培养20d后，外植体上的腋芽开始萌发，本实验共接种的外植体个数为62个，有3个褐化死亡，其余的全部萌芽，萌芽率为95.2%。萌发的腋芽生长至1cm左右时，将其从外植体上切下，接到启动培养基上继续培养30d，将从芽的周围长出丛生芽。

2.2 继代培养

把丛生芽切成单芽接种到继代培养基（表1）上进行培养，培养30d后进行观察，记录继代苗的各项指标。在我们前期的实验中，当6-BA浓度为2.5mg/L时，与不同浓度的NAA（0.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L）搭配，分别得到的繁殖系数为：5.89、5.55、5.45，3个不同的NAA浓度处理间未达到显著水平。因此，本实验设计了6-BA的浓度梯度，从中筛选出合适的6-BA浓度。从表2的结果可以看出，随着6-BA浓度的增高，继代苗的繁殖系数先升高，后降低，呈现一个明显的抛物线规律，当6-BA浓度为1.0mg/L时，繁殖系数达最高。继代苗的高度随着6-BA的浓度升高而明显降低，培养基中不含6-BA时最高，已超过培养容器的高度，但继代苗太高，容易引起营养的消耗及污染，太低则苗的质量太差，因此，应适当控制苗的高度。根据实际操作经验，继代苗的高度为3～5cm最为合适。随着6-BA浓度的增加，叶片数迅速增加，当其浓度为4.0mg/L时，在周围长了大量松散的叶片而没有有效芽（高度≥1cm的芽）的分化。由以上分析可知，甘蔗品种“粤糖55号”组培苗继代的培养基中6-BA浓度为1.0mg/L最合适。

2.3 诱导生根

把3～5cm高的继代苗丛生芽切成单芽，接种到生根培养基（表1）上进行培养，培养30d后调查甘蔗组培苗的生根数和根长。根据前期的实验发现，培养基中6-BA的存在，将会明显抑制根的分化，6-BA浓度为0.7mg/L时，NAA浓度从1mg/L提升到4.3mg/L均不能诱导生根。在没有6-BA的条件下，NAA促进甘蔗组培苗生根，在0.0～4.0mg/L的NAA浓度范围内，生根数和根长都呈先升高后降低的趋势。NAA浓度为2.0mg/L或3.0mg/L时，生根数和根长与其他浓度差异极显著，2.0mg/L时最高，平均根数和平均根长分别为34.50条、3.84cm（表3）。因此，在甘蔗品种“粤糖55号”组培苗生根过程中，使用含2.0mg/L NAA的MS培养基最合适。

2.4 炼苗移栽

甘蔗组培苗经生根诱导30d后，苗高大约为9cm，将其移到室外，在自然散射光下进行炼苗7d，将组培苗从瓶内取出，用自来水冲掉培养基，移到用木糠作基质的营养杯中进行假植，淋足定根水，假植的成活率为90%～95%。假植30d左右，待甘蔗组培苗长出新根新芽后，连基质一起移栽到大田，成活率达100%。

3 讨论

甘蔗是一种含多元酚类较高的作物，尤其是幼嫩茎尖和嫩叶鞘含量更高。在进行组织培养时，制备外植体和继代过程中细胞受到破坏，细胞内的多元酚类化合物与多酚氧化酶接触，将酚氧化成棕色的对细胞有害的醌类物质，醌类富集越多，颜色越深，褐化越严重，细胞正常生理受到破坏就越严重，严重时还通过扩散污染培养基，这就是所谓的酚为害或酚污染[9]。在本实验过程中发现，酚污染在整个组培过程中均存在。启动培养时，外植体的体积太小，则容易受酚污染为害而褐化死亡，增加外植体块的体积能明显地减轻酚污染对腋芽的为害，但外植体太大，则会增加外源菌的污染机率。本实验采用长2cm、宽1cm、厚0.5cm带腋芽的小块作外植体比较合适。继代培养和生根培养过程中产生的酚为害也会对甘蔗组培苗的组织分化与生长产生一定的影响，但在本实验过程中，未对酚污染进行处理的条件下，仍能获得较高的繁殖系数及健壮的组培苗。因此，利用茎尖脱毒快繁甘蔗健康种苗时，酚为害主要在外植体诱导丛生芽时，而合适的外植体有利于降低酚为害，而在继代和生根时影响不大。

据已报道的文献[6，10-13]，大多有关甘蔗组培快繁中的继代培养基（增殖培养基）均采用6-BA与NAA搭配使用，并且认为，当6-BA与NAA同时存在时，组培苗增殖苗数较多，但根据我们前期的实验统计数据来看，这两种激素搭配使用时，NAA浓度对甘蔗品种“粤糖55号”组培苗的继代培养影响未达显著水平，因此，建议在只含有6-BA的培养基上进行继代培养。贤武等[7]报道，桂糖26号脱毒苗的芽增殖率随着6-BA（1.5～2.5 mg/L）浓度的增加而提高。许莉萍等[14]报道，6-BA为5.0 mg/L处理在培养50 d后仍未见丛生芽，而2.0 mg/L的处理最早产生丛生芽。我们的实验结果与上述报道基本一致，即在6-BA浓度在一定范围内促进芽的分化，但高浓度反而降低芽的分化，最适合甘蔗品种“粤糖55号”诱导丛生芽增殖的6-BA浓度为1.0mg/L。此外，由于在继代培养过程中，有积累6-BA的现象，因此，随着继代培养的代数增加，应适当降低6-BA的浓度，以防6-BA浓度过高抑制丛生芽的分化。

许莉萍等[14]报道，同时附加6－BA和NAA的处理促根效果不如只含有NAA的处理。我们的实验结果与之相似，即6-BA对甘蔗品种“粤糖55号”的生根诱导具有明显的抑制作用。同时，在已报道的文献中，对甘蔗组培苗诱导生根的NAA浓度各不相同，大多数采用高浓度的NAA（≥4.0mg/L）[10-11，14，16-17]，但也有采用相对较低浓度的NAA（≤2mg/L）[13，15]。本实验结果发现NAA浓度太高太低对生根诱导均不利，2.0mg/L时，诱导的根数和根长达最大值。

综上所述，甘蔗品种“粤糖55号”腋芽的离体快速繁殖技术流程为：用带腋芽的甘蔗茎段作外植体材料，经0.1%HgCl2消毒7min后，接种到MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L的培养基上进行启动培养，然后分别用MS+6-BA1.0 mg/L和MS+NAA2.0mg/L两种培养基对甘蔗组培苗进行继代和生根培养，甘蔗组培苗生根炼苗后，移到木糠中假植30d，最后把假植的甘蔗组培苗移栽大田。

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