陈垲钿 宗凌 周蔚 刘敏 姜鸿彦

遗传因素在先天性聋病因中占重要位置。目前发现的致聋基因超过60 个，常见的有：GJB2、SLC26A4、线粒体DNA、GJB3、GJB6 等，以GJB2基因最常见［1～3］，GJB3和GJB6基因突变在遗传性聋患者中已见报道［4～6］。GJB3可表现为双等位基因座突变，或与GJB2基因表现为双基因复合杂合突变［6］。GJB3和GJB6的总体突变率较低［7～9］。

目前我国广东、湖南和广西三省的非综合征型聋患者的GJB3和GJB6基因突变资料尚缺，因此，本研究对来自这三省的200例非综合征型聋患者进行GJB3和GJB6基因突变筛查，分析这两个基因的人群突变率，为今后这些地区的耳聋人群基因筛查提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集来自广东、广西和湖南非综合征型聋散发病例200例，男118例，女82例，其中广东144例，湖南28例，广西28例，均为先天性聋或后天迟发性双耳聋。病例就诊时年龄11 月～47岁，平均7.75±6.56岁。耳聋分级参照WHO 1997年日内瓦推荐的标准，根据听力较好耳0.5、1、2、4 kHz的纯音平均听阈［10］分为：正常：＜25dB HL；轻度听力损失：26～40dB HL；中度：41～60dB HL；重度：61～80dB HL；极重度：≥81dB HL；本组患者中轻度6例，中度12例，重度33例，极重度149例。每位患者均进行详细的病史采集和系统的体格检查，排除可能的致聋病因（高胆红素血症、脑膜炎、腮腺炎后遗症等）及综合征型聋。听力学检查包括纯音听阈、声导抗和耳声发射，婴幼儿或配合欠佳患者行听性脑干反应（ABR）及听性稳态反应（auditory steady state responses，ASSR）检查。患者或其家属签署知情同意书后，采集患者外周血4 ml，采用常规氯仿抽提法提取DNA，－80 ℃保存。应用1%琼脂糖进行电泳和分光光度计进行DNA 纯度和浓度鉴定。中山大学附属第一医院医学伦理委员会审核并同意此项研究。

1.2 引物设计 GJB3引物序列为F：TACGATGGTTTTTCCTCTAATTCT，R：TTGCATAACTTAGTGAACTCAGAG，PCR 产物长度985 bp。GJB6引物序列为F：TATCACCGTGTCACTTTCC，R：CAGGTTGGTATTGCCTTC，PCR 产物长度937bp。参照文献［11］，合成检测del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）突变的引物，引物由上海生工公司合成。

1.3 PCR 扩增 PCR 反应采用25μl反应体系，2×PCR Buffer mixture 12.5μl，DNA 50ng，引物各5pmol，加ddH2O 至25μl。反应条件：94 ℃预变性5分钟，94 ℃变性30秒，56 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒，35 个循环，反应结束后再72 ℃延伸7分钟，4 ℃保存。取2μl进行1%琼脂糖电泳检测PCR 产物。del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）采用Touch－Down PCR，反应条件详见文献［11］。取6μl PCR 产物进行琼脂糖电泳，直接判断野生型或大片段缺失突变。

1.4 PCR 产物测序 PCR 产物纯化后，以PCR 引物作为测序引物进行测序反应，利用ABI公司3730测序仪进行Sanger测序反应。

1.5 序列比对 应用chromas软件分析测序结果，测序结果与GJB3 （NM＿001005752.1）和GJB6（NM＿001110219.2）基因组序列进行对比分析。

2 结果

200例非综合征型聋患者中，发现GJB3 580G＞A（A194T）杂合突变2 例，其中1 例为GJB2 109G＞A（V37I）和GJB3 580G＞A （A194T）复合杂合突变（图1），另外1例GJB2和GJB6基因均未发现突变；250G＞A （V84I）杂合突变1例（也未发现GJB2和GJB6突变），474G＞A（M158I）杂合突变1例（表1）。前两种突变位点均已见报道［7，8］，突变位于connexin 31 蛋白高度保守区，可能为病理性突变。474G＞A 杂合突变导致第158位蛋氨酸变为异亮氨酸，突变的性质暂不明确。此外，这200例患者中，发现357C＞T 杂合突变35例，357C＞T纯合突变1例，由于正常人群中也存在357C＞T 纯合突变，该突变可能为多态性突变。据此推算，广东、湖南和广西三省非综合征型聋人群中，GJB3等位基因突变频率约为1% （4／400）。

图1 GJB3和GJB2双基因复合杂合突变

表1 200例非综合征型聋患者GJB3基因筛查结果

200例患者中均未发现GJB6基因突变。对del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）的特异性PCR 扩增，电泳结果均为330bp的条带，未发现GJB6 大片段缺失突变。

3 讨论

本研究结果显示，本组非综合征型聋患者GJB3等位基因突变频率约为1%，突变位点以580G＞A为主（2例，0.5%），均未发现GJB6突变，说明GJB6在这些人群中突变率极低，在临床筛查中可暂不列为常规检测项目。

Liu等［6］报道，GJB3 基因580G＞A 突变形式表现为GJB3 580G＞A＋GJB2 235delC 或GJB3 580G＞A＋GJB2 299－300delAT 复合杂合突变，这个突变位于connexin 31蛋白高度保守区，在200例正常人群中也未发现，但在先证者的正常听力的亲代发现杂合突变。因此，这个突变可能为致病性突变，突变形式为隐性遗传。本组也有一例病例表现为GJB3 和GJB2 复合杂合突变，其中，GJB2 109G＞A 的致病性仍存在很大的争议［12，13］，GJB2 109G＞A 被认为是病理性突变［12，13］，或增加环境易感性的突变。本组GJB2和GJB3复合突变的病例，推测为遗传因素引起的耳聋，其致病机制暂不明确。

GJB3 250G＞A 突变由李庆忠等［7］首先报道，他们在150名正常对照组中未发现同样突变，各物种多种连接蛋白氨基酸序列进化分析证实该突变位点位于connexin31高度保守的第二跨膜区。关于GJB3 580G＞A 和250G＞A 的致病机制尚需进一步深入研究。此外，本组病例中发现1例患者携带GJB3 474G＞A 杂合突变，该突变引起第158 位蛋氨酸变为异亮氨酸，突变的性质暂不明确，正常人群中尚未发现携带此突变。该突变位点对应的氨基酸非位于高度保守区，推测该突变致病可能性低。

GJB6突变报道见于Marlin 等［5，11］报道，多见于欧美人群［11，14］。与GJB2 不同，GJB6 基因突变在国人耳聋患者中并不常见［8，9］。本研究广东、广西和湖南200例非综合征型聋患者中未发现GJB6突变，推测GJB6在国人非综合征型聋患者中并非主要致病基因。GJB6突变中，两种大片段缺失突变del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）比较多见［11，14］，其致病机制可能为通过反式效应（in cis effect）作用于上游的GJB2 基因，抑制GJB2基因mRNA 的表达而致聋［15，16］。本研究参照del Castillo等［11］方法，对200 例非综合征型聋患者进行这两种突变的检测，均未发现突变，与韩东一等［8，9］的研究结果一致，说明在国内耳聋人群中，GJB6基因突变可暂不列入临床常规检测项目。

本研究也存在一定的不足：首先，病例样本数量仍较少，今后需要进一步增加样本数，并合理分配病例的地域来源，以更好地验证本研究结果。其次，对GJB3可能的病理性突变位点，如GJB3 580G＞A和250G＞A 的致病机制，尚需进行深入的研究。

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