马英剑,李三强

扑热息痛又名醋氨酚、对乙酰氨基酚，小剂量不会引起肝损伤，大剂量使用时，在其代谢过程中产生的大量N-乙酰-对苯醌亚胺(NAPQI)超过了GSH的解毒能力，于是未被清除的NAPQI与生物大分子共价结合，导致蛋白质巯基被氧化和芳香基化而影响它们的功能，从而导致肝损伤[1]。热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs) 是一组广泛存在于微生物和动、植物体内的生物进化中高度保守的多肽蛋白。其中HSP70是HSPs 中最保守、最重要的一族,在大多数生物中含量最多，在应激反应中最敏感,因而是HSPs 中最受关注、研究最深入的一种[2]。本实验主要研究HSP70在对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤中的动态变化规律，进一步深入探讨HSP70在急性肝损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1材料健康清洁级昆明种雄性小鼠，体质量(22±2) g,由河南科技大学医学院实验动物中心提供；对乙酰氨基酚：广州白云山制药厂，用生理盐水稀释；HSP70鼠源性单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ALT、AST检测试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1 动物分组和模型制备 健康雄性小鼠40只分别腹腔注射对乙酰氨基酚溶液(用生理盐水稀释，550 mg/kg)，在注射对乙酰氨基酚后6，24，42，54 h分别眼球取血，分离血清测AST和ALT活性，同时取小鼠肝脏制备10%肝匀浆，每个时间点10只小鼠。同时取10只正常小鼠的血清和肝脏作为对照进行研究。

1.2.2 血清ALT、AST活性检测 按试剂盒说明书操作，测定血清ALT、AST活性。

1.2.3 HSP70检测室 利用考马斯亮蓝G250蛋白定量后取70 μg蛋白样品经SDS PAGE电泳后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉、0.1%Tween20、PBS(PBST)室温封闭膜30 min，用一抗HSP70(1∶1000)，37℃孵育1 h，PBST洗3次每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶1000)于37℃孵育1 h，DAB显色，检测阳性信号。

2 结果

2.1血清AST和ALT活性变化小鼠注射对乙酰氨基酚后，随着时间的延长血清中AST和ALT酶活性逐渐升高，24 h达到高峰，54 h逐渐恢复到正常水平，见图1。

2.2 HSP70检测结果HSP70在注射对乙酰氨基酚后6 h，其表达量略有增高，在24 h表达量达到高峰，说明小鼠肝脏的应激反应达到了高峰，此后HSP70的表达量逐渐恢复到正常水平，见图2。

图2 小鼠注射对乙酰氨基酚后肝脏HSP70表达的变化

3 讨论

本实验研究了在对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤过程HSP70的表达变化，并检测了小鼠血清中AST和ALT活性的变化，初步阐明了HSP70在对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤中的作用。HSP70具有分子伴侣的作用，当蛋白质处于非正确的天然构象的时候，那些存在于球状蛋白质内部的非疏水性氨基酸将会暴露出来，将与一些肽、核酸分子和一些大分子发生不良的相互作用。作为分子伴侣，HSP70将会解决这一问题。当新生的多肽一出现在核糖体中时，他们就结合到新生的多肽上，保护疏水的氨基酸残基不进行一些无效的相互作用[3-4]。HSP70作为分子伴侣，不断的和蛋白质结合或释放，HSP70的构象在发生着不断地变化，这种变化是在ATP的水解和交换的驱动下进行的[5]。对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤过程中，肝脏受到药物的刺激，产生应激反应，HSP70的表达量增高以帮助错误折叠的蛋白进行修复，进而促进肝脏的修复和再生。总之，本研究为进一步阐明HSP70在急性肝损伤中的重要作用奠定了基础。

参考文献：

[1] 齐艳萍,李和平.急性肝损伤动物模型制备的概述[J].甘肃畜牧兽医,2008,38 (2):37-39.

[2] 罗善明.热休克蛋白70与肝细胞肝癌的研究进展[J].重庆医学,2008,37(2):188-190.

[3] Young JC,Agashe VR,Siegers K,et a1.Pathways of chaperone-mediated protein folding in the cytosol [J].Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5(10):781-791.

[4] Bukau B,Weissman J,Horwich A.Molecular chaperones and protein quality control [J]. Cell,2006,125(3):443-451.

[5] Meimaridou E,Gooljar SB,Chapple JP.From hatching to dispatching:the multiple cellular roles of the Hsp70 molecular chaperone machinery [J].J Mol Endocrinol,2009,42(1):1-9.