张懿娜，莫 子(综述)，张 禹(审校)

(解放军第105医院放射科，合肥 230031)

通过干细胞移植来修复或替代受损组织的临床治疗方法一直是医学研究的热门，其中核心问题之一是如何观察移植后干细胞的作用部位及生长分化情况。近年来，各种迅速发展的成像技术既可以检测患者体内干细胞的位置，也提高了动物实验的可信度，尤其是磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技术可以无创无辐射地长期示踪被氧化铁颗粒标志的干细胞。

1 活体细胞成像技术的比较

干细胞按分化能力大致分为三类:①取自受精卵和早期胚胎(受精1～3 d)的全能干细胞;②从胚泡(4～15 d)内细胞群中提取的胚胎干细胞;③多能干细胞可以形成一些其他组织但并非全部三个胚层的定型细胞［1］。目前，多种疾病(如脑缺血、脊髓损伤、心肌梗死等)，均在进行干细胞移植治疗的临床试验研究，但安全性和有效性尚无定论。移植细胞的时空分布状态对于评估移植的路径、剂量、周期、效率、细胞类型来说很重要，这些信息不仅有利于监测和改进治疗方案，而且可以验证此疗法的安全和有效性。因此，用于体内细胞追踪的细胞成像技术非常重要。

用于活体研究的细胞成像技术主要有磁共振成像(magnetie resonance imaging，MRI)、CT、正电子发射计算机断层扫描(positron emission tomography，PET)、单光子发射计算机断层扫描(single photon emission tomography，SPET)、光学成像技术和超声波成像技术。临床最需要的是一个可提供高空间分辨率、深部组织探测、长时间跟踪、动态观察、环保安全的成像技术［2］。超声价格低廉，应用广泛，但其空间分辨率和探测深度难以胜任细胞显影方面的应用，虽然近些年靶向超声造影剂的实验性应用有助于提高分辨率，但是这种通过血液循环积聚在特定靶组织上的造影剂的循环半衰期较短，可能对小血管内皮细胞有害，而且超声检测敏感性较低［3］。光学技术通过被荧光转基因物质标志的供体细胞的生物发光进行细胞定位成像，可以提供优良的分辨率，但穿透力弱，且这种转基因物质目前未被批准使用［4］。因此，光学的方法仍然只能作为小动物的一种显像模式。

由于同位素标志物(例如In)的半衰期很短，SPECT的检测周期有限。PET是一种有前景的成像技术，因为其不受深度的限制能够反映细胞代谢，但是空间分辨率较差，而且面临着与SPECT同样的示踪同位素半衰期较短的问题［2］。然而，最近的基因转染技术克服了后者的限制，Cao等［5］利用PET对转染了18F标志的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的供体细胞进行了数周的跟踪。另外，微型硅元素PET探测器的开发、γ相机针孔嵌入技术的应用以及信号处理方法的进步都进一步提高了PET的空间分辨率和γ光子采集效能。新近的CT虽然应用了双源技术和迭代重建法的能谱成像，但是对于体内的细胞检测并不敏感。而且，像CT、PET、SPECT这些检查方法难以避免电离辐射，在检查中必须尽量减少活体的照射剂量。

一直以来，很多学者对MRI示踪细胞技术的兴趣浓厚，相比而言，磁共振的空间分辨率优于PET，但检测的敏感性低于PET，而且1H MRI图像有时在示踪细胞和复杂的本底信号的区分上(如含铁血黄素、出血灶、金属钙、小静脉等)缺乏特异性。研究者已经开始尝试用含19F的特殊物质标志细胞后进行19F MRI成像［6］，这种方法可排除组织本底信号，仅对浓聚的细胞群进行特异性 MRI，Himmelreich等［7］在氧化铁标志细胞MRI前使用顺磁性造影剂或吸入氧和5%二氧化碳的混合气体使血管舒张，以此减少本底小静脉的干扰。新近的化学饱和位移传递依赖的造影剂的使用不仅可以通过选择性饱和脉冲进行切换式增强成像来降低本底信号，而且可以与超顺磁性氧化铁颗粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)共同进行MRI增强成像，这为MRI同时检测两种不同细胞群落提供了可能性［8］。无论如何，MRI在空间分辨率和检测敏感性之间拥有良好的平衡，而且无电离辐射，这些优点使MRI成为一种最实用的细胞显像技术。

2 用外源性氧化铁颗粒标志干细胞

静脉注射氧化铁离子颗粒的磁共振细胞成像主要用于网状内皮系统细胞的示踪，应用有限。MRI的另一种细胞示踪法是在体外用氧化铁颗粒标志细胞，细胞标志可在细胞膜上黏附氧化铁颗粒或把他们载入细胞内，目前已经有很多的细胞类型被氧化铁颗粒标志，并且被MRI记录，如T细胞、单核细胞、胶质瘤细胞、神经干细胞、巨噬细胞、原始内皮细胞等［9-10］。

干细胞MRI监测的敏感性主要受限于被摄取的氧化铁微粒数量，每个细胞载有的氧化铁微粒越多，则信噪比和分辨率越高。因此，要不断改进标志技术来增加干细胞对氧化铁颗粒的摄取量，然而氧化铁微粒的干细胞摄取受到细胞表面特定受体、颗粒理化性质、细胞种类、培养基性质等多种因素的影响。

2.1 颗粒表面成分和电荷特性对干细胞摄取的影响 氧化铁颗粒常包被右旋糖酐或者其他成分，这种包被材料常携带静电荷，在水中，颗粒在水分子的碰撞及相互静电排斥力下做布朗运动，从而保持悬浮状态而不发生凝聚。实验者设计了不同的颗粒外衣来增强或者避免颗粒-细胞相互作用，例如聚乙二醇化的氧化铁颗粒可避免细胞膜上调理素作用，最终被巨噬细胞所吞噬［9］，这是因为聚乙二醇外衣具有亲水性、电中性，而没有氢供体或受体，从而与调理素之间缺乏亲和力。颗粒外衣的电荷极性也会影响摄取，Harush-Frenkel等［11］比较了与 SPIO 相似大小的分别带阳性和阴性电荷的多乳酸化合物颗粒，发现带阳性电荷者更易被HeLa细胞摄取，这是因为阴离子颗粒只通过胞吞作用，而阳离子颗粒除了由网格蛋白和细胞质膜微囊介导的胞吞外，还通过巨胞饮作用摄取。

由电荷性质所自然附属的颗粒电位可能也对细胞摄取效率起着重要的作用，研究者发现包被有柠檬酸盐外衣的超小超顺磁性氧化铁颗粒(very small superparamagnetic iron oxide particles，VSOP)相对于相似大小的其他无电荷颗粒来说，可更好地被巨噬细胞摄取，而包被有酸质外衣的AMNP(acid-coated anionic magnetic nanoparticle)(电位为 -30 mV)，相对于相似大小不携带电荷的包被右旋糖酐外衣的ferumxotran，更易被巨噬细胞及HeLa细胞吞噬［12］。

2.2 氧化铁颗粒配体耦联对干细胞摄取的影响利用生物配体耦联氧化铁颗粒来促进受体介导的细胞吞噬作用是一种改进的方法。Liwen等［13］发现在标志浓度(指培养液单位体积内的铁含量)约0.1 mg Fe/mL时，与右旋糖酐氧化铁结合物颗粒相比，人类免疫缺陷病毒转录反式因子与胺化的右旋糖酐交叉联合的氧化铁结合物颗粒能更好地被脾脏内皮细胞摄取。当然，TAT(trans-activator transcription)介导的氧化铁颗粒进入细胞的机制尚有争论。有观点认为这不依赖于细胞表面受体而是通过脂筏介导的巨噬细胞吞噬作用，也有的认为TAT本身进入细胞可能不依赖受体，但是与其他大分子耦联进入细胞则需要受体介导的细胞吞噬作用［14］。除了肽类，抗体也能介导受体的细胞吞噬作用，多种细胞膜上都含有大量的转铁蛋白受体，转铁蛋白抗体标志SPIO能促进人类造血干细胞对铁离子的摄取，摄取浓度高达每细胞9.8 pg，远超过对普通SPIO的摄取浓度每细胞 2.4 pg［15］。CD11c(树突状细胞特异性抗体)则能促进树突细胞对SPIO的摄取［16］。

以抗体参与的定向受体介导的细胞吞噬作用有个固有的问题，就是对靶受体的种族特异性的附着，这就要求每个抗体耦联的SPIO有特异对应的目标种属和细胞类型;抗体在人和其他动物体内具有交叉性，这可能涉嫌与异种基因移植方面的条例相悖;抗体的成本昂贵。因此，该方法可能更多地用于人体外实验。

2.3 颗粒大小对干细胞摄取的影响 颗粒被细胞吞噬的速度和数量与其组成和直径都有关系。对于巨噬细胞而言，当颗粒直径＜2 μm时，被摄取的颗粒数量与颗粒的直径呈正比例关系;当直径由2 μm增加到4.6 μm时，被摄取的颗粒数目逐渐减少，这是因为此时颗粒的大小已接近细胞大小的缘故。有的细胞仅吞噬某一种特定颗粒，如白细胞更多地吞噬直径500 nm至1 μm的苯乙烯化合物颗粒，对其他大小的颗粒几乎不摄取。关于SPIO也有相似结果，吞噬细胞和单核细胞更多的吞噬直径约60 nm的包被有羧基化右旋糖酐的SPIO，而不是有类似外衣但直径更小的SPIO颗粒。

关于颗粒大小对非吞噬细胞吞噬作用的影响的研究较少。Matuszewski等［17］比较后发现，当包被有羧基化右旋糖酐外衣的SPIO颗粒直径介于17～65 nm之间时，肺癌细胞较多地吞噬较大的颗粒。Rejman等［18］证明当聚苯乙烯颗粒的直径在 50～500 nm范围内增加时，鼠黑素瘤细胞对它的吞噬作用逐渐减弱，当颗粒达到1 μm时，则不再被吞噬。Thorek等［19］发现，当用直径33 nm以上的氧化铁颗粒逐步标志人类T细胞时，其摄取能力在颗粒直径为107 nm时达到顶峰，而在107 nm至1.4 μm范围内时摄取作用逐渐减弱。其实在Thorek等［19］的研究中要准确推断出T细胞摄取不同颗粒直径的模式是很难的，因为他采用了不同外衣的多种颗粒，如右旋糖酐(33～107 nm)、苯乙烯(207～289 nm)、二氧化硅(1.4 μm)包被的颗粒。如前所述，氧化铁颗粒的外衣性质也对摄取有影响。Lee等［20］发现骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)对氧化铁微凝胶体(microgel iron oxide particles，MGIO)的摄取能力和大小有依从性，在直径78～766 nm时，600 nm的MGIO可以达到每细胞33 pg的最大摄取浓度，这是ferucarbotran制剂的3～6倍。有趣的是，内皮干细胞无论是用600 nm的MGIO标志还是用ferucarbotran标志，对铁的摄取浓度是一样的(每细胞 26～28 pg)［10］。

因此，有些细胞摄取能力与颗粒大小有依赖性，比如单核细胞、肺癌细胞及黑素瘤细胞，而巨噬细胞和BMSC在某个特定的颗粒直径时会有最大的摄取能力。另外，一些细胞现在仍不能确定是对颗粒大小无选择性还是对颗粒外衣性质不敏感，比如内皮祖细胞。相对于巨噬细胞，非吞噬细胞可能是在很小的直径范围内最大量地吞噬颗粒。

（3）钻孔爆破要求高。①由于该水电站工程为长缓坡钻孔模式，而高拱坝拱肩槽开挖基面坡度最低在1/2.3之间，整体坡度变化趋势不够明显，对预裂钻孔角度控制提出了较大的难题；②在工程施工期间，要求预应力锚固区质点振动速率在1.5～2.0cm/s之间，而岩体振动速度应在9.0cm/s以下，对振动爆破要求较高。

2.4 标志的持续时间和浓度对干细胞摄取的影响

目前认为无论颗粒类型、大小及细胞类型，标志的持续时间和标志浓度与颗粒的细胞摄取浓度均呈正相关，但两者达到一定程度后细胞摄取出现饱和状态。Thorek等［19］发现，对＜100 nm包被右旋糖酐外衣、200～300 nm 苯乙烯外衣及1.4 μm 二氧化硅外衣的氧化铁颗粒的T细胞摄取浓度，随标志时间的延长而有所增加，但在4 h后达到饱和。另外，还证实＜100 nm包被右旋糖酐外衣的颗粒的摄取在标志浓度25 mg/L时达到饱和，后两种颗粒则在标志浓度100 mg/L时达到饱和。Wilhelm等［12］用30 nm的AMNP分别标志HeLa细胞和巨噬细胞，在标志浓度同样是500 mg/L情况下，两种细胞达到饱和的持续时间分别为5 h和10 h，这也进一步说明了不同细胞种类的标志效率的差异性。大多数学者认为，尽管随着标志浓度的增加摄取浓度可以升高，但培养液内过多的聚合物和自由基能抑制干细胞分化、引起细胞凋亡、降低细胞能动性，因此一般遵循最长24 h的标志持续时间和最大200 mg/L的标志浓度。

2.5 电穿孔和转染试剂在干细胞摄取中的应用受DNA转染技术的启发，电穿孔和转染试剂(transfection agents，TA)被用于促进细胞对氧化铁颗粒的摄取。电穿孔法转染基因的方法是将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流作用下细胞膜出现许多小空洞，外源DNA通过小空洞进入胞内，现在此法已成功用于细胞的SPIO标志。Walczak等［21］在用ferumoxide标志鼠 MSC时运用电穿孔技术，使铁的摄取浓度达到每细胞11.5 pg，而普通标志的摄取浓度为每细胞3 pg。电穿孔法标志效率虽然很高也不影响细胞活性，但制约因素太多，如电压、电流、持续时间、溶液导电性、酸碱度等，因此实际应用难度大，一旦电参数调整不当将影响细胞活性和标志效率。

用于SPIO标志的转染试剂主要有阳离子物质和脂质体两种，最常用的是阳离子物质多聚左旋赖氨酸(poly-l-Lysine，PLL)和硫酸鱼精蛋白。将PLL与ferumoxide按一定比例调制成络合物后，再与人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)一起培养，hMSC摄取浓度可以达到每细胞116 pg，硫酸鱼精蛋白与ferumoxide形成的络合物可使hMHC摄取浓度达到每细胞11 pg［22］。虽然这些阳离子转染因子能促进细胞的摄取，但不是毫无缺陷。Arbab等［23］用Ferumoxide-鱼精蛋白标志hMSC时发现hMSC的全部分化能力不受影响，但Kostura等［24］发现用 Ferumoxide-PLL标志法会影响干细胞的软骨分化能力。看来这种有害效应是PLL的结果，而非ferumoxide的影响，目前关于转染试剂对干细胞活性影响的详细试验仍较缺乏。另有学者的研究［25］表明，表面上看lipofactamine脂质体转染试剂介导的SPIO摄取量增加了，但只是与细胞膜的结合，并不是真正的细胞内摄取，而硫酸鱼精蛋白虽然能使ferumoxide在小鼠的神经干细胞中进行完整的细胞内摄作用，但在其他类型的细胞中该作用则不完全。这是否说明转染试剂标志法的细胞摄取SPIO能力与转染试剂的类型、标志条件和细胞类型有关呢?

另外，转染试剂标志法的另一个特征是虽然细胞吞噬作用可随着铁粒子的标志浓度增加而增强但不呈线性关系，同时还可以提高细胞摄取的饱和阈值从而进一步提升标志浓度。这个现象可能和TA-SPIO络合物的组分相对含量引起自身特性的动态变化有关，这方面的了解和TA-DNA络合物比起来还不够深入，TA-DNA的络合物由于两者组分的相对含量不同，可以形成球状、杆状和环状结构，而且在几个小时内可以动态地变化。已有学者［26］证实，TA-SPIO的络合物直径依赖于它的组分的相对含量，在一定比值时会产生沉淀。因此，使用转染试剂标志法时针对不同细胞类型和标志浓度都需要一种不同的最佳条件，而做到这一点是很难的。

2.6 培养液的性质对干细胞摄取的影响 在标志细胞时，颗粒的理化性质会受到培养液微环境的影响。研究发现［21］，和无血清的培养液比较，含10%血清的培养液可以增加ferumoxide的摄取。单晶质氧化铁颗粒(monocrystalline iron oxide particles，MION)受血浆的调理后，巨噬细胞和癌细胞摄取浓度分别增加6倍和2倍，这是由于受调理素作用的MION是通过补体C3介导的巨噬细胞清除作用被摄取的，其效率高于通过细胞吞噬的入胞作用。但是，Wilhelm等［12］却发现HeLa细胞对受调理素作用后的AMNP的摄取会由原来的每细胞16 pg降低至每细胞1 pg。实际上，在对PLL-SPIO络合物的摄取过程中，浆核比较大的细胞对培养液中血清的存在不敏感，而在无血清培养液中，浆核比较小的造血系细胞的摄取则会增加［2］。总之，含或不含血清的培养液对不同类型的细胞摄取浓度的影响是不同的。

3 用转基因方法进行内源性氧化铁标志干细胞的研究进展

活体中有专门贮存氧化铁的机制，包括铁蛋白、转铁蛋白和转铁蛋白受体，这些蛋白质在特定细胞中的表达会随着细胞内铁的贮存量的增而增多，使这些细胞能被MRI检测到。促进细胞产生内生性的氧化铁颗粒或可取代外源性颗粒标志细胞。

3.2 铁蛋白 铁蛋白是人体细胞内铁的重要储存形式。Grabile等［28］利用11.7 T高分辨率基于体素的MRI发现剔除铁调节蛋白2的小鼠脑内由于铁蛋白铁过载引起的低T2值像素量增多，由此推测MRI或可检测铁代谢异常。然而，Cohen等［29］发现通过在转基因小鼠的心和肝脏中诱导过多的铁蛋白表达，MRI虽检测到这些组织的弛豫率产生了25%的变化，但细胞内铁含量仅增加每细胞0.2 pg，所以诱导基因表达的MRI细胞显像敏感性并不会很高。Deans等［30］用铁蛋白和转铁蛋白受体基因共同转染的方法也只使细胞内铁含量增加每细胞14 fg，对敏感性的改善无太大贡献。最近Bennett等［31］试图通过调控铁蛋白的聚集反应来升高相同铁含量干细胞的弛豫率，以此提升MRI细胞显像的敏感性。

3.3 趋磁细菌的magA基因 趋磁细菌是一种在体内形成纳米磁性颗粒(磁小体)，并能在外磁场作用下作定向运动的细菌，这些磁小体由包有类脂膜的复杂的氧化铁结晶组成，它无生物毒性、颗粒小、形态大小均一、颗粒间不聚集，目前已证实magA基因是菌体内参与磁小体产生的基因之一。Zurkiya等［32］将一种常用的人包装细胞株293FT细胞转染magA基因后，293 FT细胞可以产生直径3～5 nm磁小体颗粒，使细胞内铁的含量增加每细胞0.55 pg。MagA的应用研究虽然还处在初期，但目前的结果说明它将是很好的磁共振报告基因，其发展前景十分广阔。

4 结语

MRI作为一种能够探测被氧化铁标志的细胞的成像方法，具有活体监测、长时间跟踪、高空间分辨率等优势，近年来外源性氧化铁颗粒标志干细胞方法已经得到很大的改进，新近的用转基因方法进行内源性氧化铁颗粒标志干细胞的方法也方兴未艾，这些方法在更好稳定干细胞活性的基础上为进一步提高MRI对干细胞的检测敏感性和特异性提供了更广阔的发展空间。而影响干细胞对氧化铁颗粒摄取数量和能力的因素很多，因此在寻找一种能够转变为临床应用的标志方法的过程中，干细胞MRI显像仍面临诸多挑战，包括:①标志浓度的下降，研究表明细胞内的标志物在两个子代细胞中的含量近似平分，如果移植的细胞快速分裂，那么标志物的浓度下降过快并可能会影响监测;②标志物的转移，已经有学者［33］发现，干细胞内的氧化铁颗粒可以转移到宿主的巨噬细胞而导致对植入的干细胞增殖、分化等情况误判;③干细胞的定量，氧化铁标志的干细胞MRI的细胞定量方法仍在起步阶段，已有学者［34］尝试分析氧化铁颗粒标志干细胞的R2*弛豫率与细胞数量之间的关系;④尽管探索了一些新方法，但从本体的低信号中探测少量细胞仍是困难的。另外，部分容积效应、信噪比、空间分辨率、扫描时间、后处理算法等如何平衡才能将MRI的干细胞检测敏感度达到最佳水平也要在工作中不断总结。

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