宣吉晴 XUAN Jiqing

李明星1 LI Mingxing

陈晓梅1 CHEN Xiaomei

罗志建1 LUO Zhijian

郭庆喜2 GUO Qingxi

2. 泸州医学院病理教研室 四川泸州 646000

肾脏作为高灌注器官，极易发生肾缺血-再灌注损伤（ischemic reperfusion injury, IRI）。IRI对肾脏的功能和组织结构均可造成明显损伤，可引起肾脏细胞凋亡，肾实质细胞丧失、细胞数目减少，引起血管收缩，降低肾脏血供，导致肾功能急剧下降。目前临床上对于肾IRI的研究多见于血清生物化学、分子生物学及病理学检测。彩色多普勒超声作为一种实时、无创性检查手段，能客观动态地显示肾皮质血流灌注情况，从而提示肾缺血-再灌注后肾损伤的存在。细胞凋亡（apoptosis）是缺血-再灌注组织和器官损伤的途径之一[1]，而bcl-2是体内重要的抗凋亡基因，肾缺血-再灌注后在远端肾小管高度表达保护肾功能[2]，测定肾小管上皮中Bcl-2蛋白的表达可以了解肾损伤的程度，判断预后。本研究通过建立兔肾缺血-再灌注损伤模型，运用彩色多普勒血流显像（CDFI）及脉冲多普勒（PW）技术检测肾叶间动脉血流动力学改变，并检测肾小管上皮Bcl-2蛋白表达情况，分析两者间动态变化的关系，从而评价彩色多普勒超声对兔肾缺血-再灌注损伤程度的检测价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 兔肾缺血-再灌注损伤模型制备 健康成年日本大白兔48只（由泸州医学院实验动物中心提供），雌雄不限，体重1.8～2.4kg，平均（2.1±0.2）kg。经耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠1.5ml/kg（中国医药集团上海化学试剂公司）麻醉，兔取仰卧位固定于手术台上，上腹部备皮，行正中切口，约5cm，沿腹白线逐层分离，剪开腹膜，用湿纱布拨开肠管，暴露肾脏，切除右肾，以玻璃针小心分离左肾动、静脉，保护输尿管，用无创性动脉夹夹闭左肾动脉，阻断血流1h，然后松开动脉夹恢复血供24h，复制肾缺血-再灌注损伤模型。缺血时观察肾脏由鲜红色立刻变为暗红，恢复灌注后肾脏颜色恢复鲜红，表明急性肾缺血-再灌注模型制备成功。

1.1.2 实验分组 48只兔随机分为两组：①缺血-再灌注组（I/R组，n＝24），上述模型在恢复血流后根据时间又分为2h、8h、24h三个亚组；②假手术组（sham operation，S组，n＝24），仅行开腹、切除右肾，关腹；根据保留左肾时间分为2h、8h、24h三个亚组。

1.1.3 仪器及试剂 采用GE Logiq 9多普勒超声诊断仪（通用电气，美国）；荧光显微镜（日本尼康80i）；Bcl-2成套免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 观察指标 运用CDFI显示肾动脉血流信号，各亚组均于术后2h、8h、24h运用PW取样容积于肾椎体两侧缘叶间动脉获取3个以上稳定一致的血流频谱，选用高频线阵探头，探头使用中心频率为10.0MHz，调整仪器设置，总增益为100，深度为5cm，量程为0～60cm/s，声束与血流方向夹角＜60°，连续测量3次肾叶间动脉血流动力学参数，取平均值，并保存图像。肾叶间动脉血流动力学参数测定指标采用描记多普勒波形、仪器自动分析测量收缩期峰值流速（Vmax）、舒张末期流速（Vd）、时间平均峰值流速（Tamax）、搏动指数（PI）和阻力指数（RI），PI及RI按下式计算：PI＝（Vmax－Vd）/Tamax；RI＝（Vmax－ Vd）/Vmax。为减少因手法不同而产生的测量差异，均由同一人在相同的测量部位操作。

1.2.2 标本采集 完成左肾动脉血流动力学测量后，根据分组情况在不同时间点处死动物，在低温条件下开腹切除左肾，取部分左肾皮质组织以10%甲醛固定，待测。肾组织经脱水、透明、浸蜡和包埋，常规切片（3μm）。一张作HE染色，制片显微镜观察病理变化情况，分析肾小管损伤程度；另一张作免疫组化。

1.2.3 免疫组化SABC法测定肾小管中Bcl-2蛋白表达 ①免疫组化法染色：严格按照Bcl-2试剂盒说明操作。②结果判断：400倍光镜下观察，照像。胞质内或细胞膜呈棕黄色染色为阳性，不着色为阴性。每张切片随机选取10个视野，采用Image Plus Pro 6.0图像分析软件进行分析，计算阳性细胞的平均光密度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0软件分析，数据以表示，组间、组内比较采用t检验；肾叶间动脉Vmax、Vd、Tamax、PI、RI与肾组织Bcl-2蛋白表达相关性采用Pearson直线相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDFI检测兔肾叶间动脉血流动力学变化 二维超声声像图均能清晰显示大白兔左侧肾脏，CDFI显示各组肾叶间动脉血流充盈良好（图1）。I/R组2h亚组与S组各亚组比较，肾叶间动脉血流动力学变化差异均无统计学意义（P＞0.05）；I/R组8h亚组与S组各亚组比较，肾叶间动脉RI增大（P＜0.05），而Vmax、Vd、Tamax、PI差异均无统计学意义（P＞0.05）（图2）；I/R组24h亚组与S组各亚组比较，肾叶间动脉Vmax升高，RI及PI增大（P＜0.05），而Vd及Tamax差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 肾小管病理改变 光镜下，S组肾小管均未见明显病变，I/R组随再灌注时间的延长，肾脏组织发生不同的病理改变。缺血-再灌注后2h，肾小管出现肿胀，部分细胞出现空泡样变性；缺血-再灌注后8h，肾小管肿胀加重，管腔内出现坏死脱落组织（图3）；缺血-再灌注后24h，肾小管损伤程度最重，表现为大片肾小管上皮细胞肿胀呈空泡样，肾小管中可见大量死亡脱落细胞残留物质，间质及小管内炎症细胞浸润（图4）。

2.3 肾小管上皮细胞Bcl-2表达变化 正常肾小管上皮Bcl-2呈弱阳性表达，缺血-再灌注后Bcl-2表达上升，主要表达于外髓及远曲小管，明显较近曲小管强（图5），随时间推移表达范围增加。I/R组2h、8h、24h平均光密度值与S组2h、8h、24h比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。I/R组Bcl-2表达24h（图6）达高峰，与I/R组8h亚组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），但I/R组8h与2h比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 缺血-再灌注各亚组肾血流动力学与Bcl-2蛋白表达的相关性分析 缺血-再灌注各亚组肾叶间动脉Vmax、PI、RI的改变与肾小管上皮细胞Bcl-2蛋白表达变化呈显著正相关（r＝0.572、0.416、0.647，P＜0.05），而Vd、Tamax与Bcl-2表达均无明显相关性（r＝0.154、0.213，P ＞ 0.05）。

表1 两组肾叶间动脉血流动力学参数比较（ ）

表1 两组肾叶间动脉血流动力学参数比较（ ）

注：（1）与S组比较，P＜0.05。Vmax：收缩期峰值流速；Vd：舒张末期流速；Tamax：时间平均峰值流速；PI：搏动指数；RI：阻力指数

表2 两组兔肾缺血-再灌注后各时间点Bcl-2表达比较（ ）

表2 两组兔肾缺血-再灌注后各时间点Bcl-2表达比较（ ）

注：（1）与S组比较，P＜0.05；（2）与8h比较，P＜0.05

3 讨论

随着彩色多普勒超声技术的发展，因其无创、快捷、简便、易于重复动态观察等优点在临床上广泛用于观察肾脏疾病的血流动力学变化，如肾移植、肾血管病变等，其中血流指标研究最多的参数是RI，多数学者研究段动脉、叶间动脉[3-8]。正常肾功能的实现有赖于肾脏的血流供应及血流在肾内的分布，而微循环障碍和血流动力学、血液流变学改变是肾缺血-再灌注损伤发生的重要机制之一[9]，因此，了解肾血流的供应和分布将有助于对缺血-再灌注时肾损害的程度作出准确评估。一些学者在移植肾的研究中发现，当移植肾出现急性排斥反应及急性肾小管坏死时叶间动脉和弓形动脉变化较肾主动脉及段动脉明显[10]，因此本研究选择叶间动脉作为观察指标。

在恢复灌注后的早期，肾血管重新充盈，组织累积缺氧量的需要和损伤产生的代谢产物会使血管持续扩张，血流量比缺血时明显增加[11]。本研究发现，再灌注2h时I/R组与S组比较，叶间动脉Vmax、Vd、Tamax、PI、RI差异均无统计学意义（P＞0.05），但此时病理切片较S组已有改变，显示肾小管肿胀，管腔开始扩张，部分细胞出现空泡样变性，其原因可能是再灌注时间较短，已经出现肾损伤，肾皮质血流速度可能有一定改变，或稍有升高的趋势，但变化不明显，此时的血流动力学改变敏感性差。再灌注8h时I/R组叶间动脉RI显著增大，与2h时比较，差异有统计学意义（P＜0.05），结合病理改变，考虑原因可能是随着肾缺血后再灌注损伤的加重，血管壁增厚，血管内皮细胞肿胀，引起血管腔缩窄，弹性降低，阻力进一步增加。再灌注24h时I/R组Vmax升高，PI及RI增大，Vd有所下降，而Tamax变化不明显。此时病理表现肾损伤更为严重，大部分近曲小管上皮细胞呈空泡样变，上皮细胞脱落至管腔明显，并可见间质充血和白细胞大量浸润。研究表明，随着缺血-再灌注时间推移，肾组织损伤产生并释放花生四烯酸代谢产物，进而吸引大量白细胞黏附于内皮细胞上，引起肾小管周围毛细血管网阻塞限制再灌流，血流阻力显著增加[12]。这可能是再灌注24h后频谱探测到叶间动脉出现收缩期血流速度加快、舒张期流速下降、阻力指数明显增高的原因。

Bcl-2是研究最早的抗凋亡基因之一，在缺血-再灌注损伤中表现得尤为突出[13]。Bcl-2抗细胞凋亡的作用机制可能与以下几个方面有关：①抑制Ca2+的释放。②Bcl-2通过阻止促细胞凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物发挥作用。③抑制细胞色素C的释放，产生细胞内抗氧化作用。本研究观察到，兔正常肾小管上皮细胞Bcl-2呈弱阳性表达，缺血-再灌注损伤后随时间推移Bcl-2表达增强，但8h组变化较2h组差异无统计学意义（P＞0.05），于再灌注24h后表达最高，较8h组差异有统计学意义（P＜0.05）。肾小管上皮Bcl-2随着缺血-再灌注损伤的加重表达增加，表明肾脏可能通过上调Bcl-2的表达拮抗缺血-再灌注损伤，从而起到保护肾功能的作用。兔肾缺血-再灌注24h内肾叶间动脉Vmax、PI、RI与Bcl-2表达呈显著正相关（r＝0.572、0.416、0.647，P＜0.05），叶间动脉Vmax、RI及 PI与Bcl-2峰值出现时间相同，RI与肾组织Bcl-2蛋白表达的变化具有很强的平行性。

综上所述，随着缺血-再灌注的时间推移，病理切片显示肾损伤加重，肾小管上皮细胞Bcl-2表达增强，肾叶间动脉血流动力学也随再灌注时间的延长发生改变，故监测肾组织末端血管血流动力学改变是评价兔肾IRI的有效方法。彩色多普勒超声能及时反映肾血流灌注异常，能为临床对肾缺血-再灌注损伤提供可靠的诊断信息。正确认识和分析超声多普勒频谱，特别是RI，对判断肾缺血-再灌注损伤程度至关重要。

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