王国峰，赵 霞，李 宁，陈冬梅

(1.济南军区总医院干部病房三科，山东 济南 250031;2.中国科学院生物物理研究所脑与认知科学中心，北京 100101)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是多因素诱导的慢性炎性疾病，内皮细胞功能异常为其始动环节［1－4］。脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)可与内皮细胞 TLR4(Toll-like receptor 4)受体结合，激活MAPK、JAK/STAT等信号通路，促使NF-κB入核，导致炎症和黏附分子表达［5］，LPS在 AS整个发生发展过程中都起着非常重要的作用［6］。花生四烯酸(arachidonicacid，AA)通路在内皮细胞活化相关的信号转导及内膜增殖中发挥重要作用。其中限速酶——环氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和 5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LOX)，可催化炎症因子PGE2及白三烯类(leukotriene，LTs)生成，在泡沫细胞中大量表达［7］。5-LOX结合蛋白(5-lipoxygenase activating protein，FLAP)是定位于核膜上的膜结合蛋白，介导LOX锚定到核膜上，FLAP基因突变与心梗危险性密切相关，FLAP抑制剂MK-886可减轻载脂蛋白E和低密度脂蛋白受体双敲除小鼠AS斑块形成［8］。

川芎嗪(ligustrazine，LIG)是川芎的主要活性成分，广泛应用于治疗心绞痛和脑缺血［9］。近年有报道LIG保护内皮细胞，提高机体NO水平等［10］，但对于内皮细胞上其他受体及信号转导系统的研究均无涉及。

本文从内皮损伤这一始动环节入手，以LPS诱导原代培养人冠状动脉内皮细胞炎症模型，观察LIG对AA通路炎症反应的影响;进一步研究对其偶联的MAPK和STAT通路的影响。为深入理解LIG抗AS机制，拓展其临床适应症奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系 人冠脉内皮细胞系CC-2585(批号1F2025)及培养基EGM-2(含胎牛血清及7种生长因子如 hydrocortisone、hFGF-B、EGF、R3-IGF-1、ascorbic acid、hEGF、GA-1000)购于毕龙公司。

1.2 药品与试剂 盐酸LIG(纯度98.5%):中国药品与生物制品检定所。I型胶原酶、胰蛋白酶:Sigma公司产品;DMEM培养基、新牛血清:Gibco公司产品;LPS:Sigma公司产品;COX-2、5-LOX、FLAP、p-p38MAPK和 p-STAT3抗体购自 Santa Cruz Biotechnology Inc;SuperSignal West Pico chemiluminescent substrate购自 Pierce(Rockford，IL)。其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 人冠脉内皮细胞的培养 T25培养瓶用2%明胶包被，4℃过夜，将CC-2585人冠状动脉内皮细胞从液氮中取出后37℃水浴3 min使之解冻后均匀分到培养瓶中，加入人的培养基EGM-2后37℃，5%CO2孵箱中培养，24 h细胞贴壁后第1次换液。以后按常规培养，细胞长至融合，按1∶2进行传代。

1.4 LPS诱导的内皮细胞炎症损伤实验模型 将细胞以2 ×108·L－1接种于6 孔板，每孔1.5 ml，细胞总数为3×105个/孔，待细胞稳定24 h后，用无血清EGM-2培养基预处理(pH 7.2)，LIG以EGM-2培养基配置成浓度为1 mmol·L－1的浓缩液。内皮细胞分组如下:①正常对照组(培养基中为标准内皮细胞培养液);②LPS组(培养基中加入终浓度为1 mg·L－1的 LPS孵育2 h);③ LPS+LIG 组:在给予 LPS前，以LIG(1 和10 μmol·L－1)预处理细胞6 h;④ LPS+LIG+p-p38MAPK抑制剂SB203580或JAK2抑制剂AG490组:在给予LPS前，以LIG(10 μmol·L－1)和 p-p38MAPK 抑制剂 SB203580(20 μmol·L－1)或 p-STAT3抑制剂 AG490(30 μmol·L－1)同时预处理细胞6 h。

1.5 Western blot RIPA裂解液 (Tris-HCl 50 mmol·L－1，pH 7.4 NaCl 150 mmol·L－1，EDTA 1 mmol· L－1，Na-deoxycholate 0.25%，NP-40 1%，PMSF 1 mmol·L－1，Na3VO41 mmol·L－1，NaF 1 mmol·L－1，Aprotinin 10 mg·L－1，leupeptin 5 mg·L－1，pepstatin 5 mg·L－1)重悬 5×106cells，冰上裂解45 min。裂解液14 000×g离心15 min。Lowry法测定上清中的蛋白浓度。样品经SDS/PAGE电泳分离后转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭1 h，然后一抗4℃孵育过夜。TBST洗3次，每次10 min，然后与二抗孵育1 h。TBST洗3遍后显影。

2 结果

2.1 对COX-2蛋白表达的影响 LIG对LPS诱导内皮细胞COX-2蛋白表达的影响如Fig 1所示，LPS可诱导COX-2蛋白表达水平增高，LIG 1和10 μmol·L－1，可使其蛋白水平分别降低为模型组0.21倍和0.25倍(P＜0.01);p-p38MAPK抑制剂SB203580则可使其蛋白水平增高为LIG(10 μmol·L－1)组的4.17倍(P＜0.01)。

2.2 对5-LOX蛋白表达的影响 LIG对LPS损伤内皮细胞后5-LOX蛋白表达的影响如Fig 2所示。LPS可诱导5-LOX蛋白表达水平增高，LIG 1和10 μmol·L－1，可使其蛋白水平分别降低为模型组的0.20倍和0.37倍(P＜0.01);SB203580则可使其蛋白水平增高为 LIG(10 μmol·L－1)组的1.16倍(P＜0.01)。

2.3 对FLAP蛋白表达的影响 LIG对LPS损伤内皮细胞FLAP蛋白表达的影响如Fig 3所示。LPS可诱导 FLAP蛋白表达水平增高，LIG 10 μmol·L－1，可使其蛋白水平降低为模型组的0.42倍(P＜0.01)，1 μmol·L－1低剂量组对 FLAP 蛋白表达无影响(P＞0.01);SB203580则可使其蛋白水平增高为 LIG(10 μmol·L－1)组的2.89 倍(P＜0.01)。

2.4 对MAPK通路磷酸化激活的影响 LPS可诱导MAPK通路中p38MAPK磷酸化水平升高而激活，LIG 1 和 10 μmol·L－1，可使其磷酸化水平分别降低为模型组的0.50倍和0.07倍(P＜0.01);SB203580则使其磷酸化水平增高为LIG(10 μmol·L－1)组的17.80倍(P＜0.01，Fig 4)。

Fig 1 Effect of ligustrazine on the protein expression of COX-2 in coronary endothelial cells induced by LPS(±s，n=4)

Fig 2 Effect of ligustrazine on the protein expression of 5-LOX in coronary endothelial cells induced by LPS(±s，n=4)

2.5 对JAK2/STAT3通路磷酸化激活的影响LPS可诱导JAK2/STAT3通路中STAT3蛋白磷酸化水平升高而激活，LIG 1 和 10 μmol·L－1可使其磷酸化水平分别降低为模型组的0.48倍和0.28倍(P＜0.01);JAK2特异性抑制剂AG490则使其磷酸化水平增高为LIG(10 μmol·L－1)组的4.55倍(P＜0.01，Fig 5)。

Fig 3 Effect of ligustrazine on the protein expression of FLAP in coronary endothelial cells induced by LPS(±s，n=4)

1:Control;2:LPS;3:LPS+LIG(1 μmol·L－1);4:LPS+LIG(10 μmol·L－1);5:LPS+LIG(10 μmol·L－1)+SB203580.＊＊P＜0.01vscontrol;##P＜0.01vsLPS;△△P＜0.01vsLPS+LIG

Fig 4 Effect of ligustrazine on the protein expression of p-p38MAPK in coronary endothelial cells induced by LPS(±s，n=4)

3 讨论

3.1 抑制花生四烯酸炎症通路，改善内皮功能为其抗AS关键环节 目前关于LPS在AS形成中对AA通路炎症反应及其信号通路的研究尚不够系统和深入，尚无靶向内皮细胞，抑制该通路及其相关信号转导系统的安全有效、毒副作用低的临床药物应用。但国内外已有研究表明，AA代谢的限速酶COX-2、5-LOX及结合蛋白FLAP在AS发生发展的不同阶段均发挥重要作用［11］。免疫组织化学研究也表明:5-LOX、FLAP及LTA4水解酶等在AS斑块区表达明显增加，并与内膜损伤区的巨噬细胞共定位，5-LOX强效抑制剂VIA-2291可剂量依赖性地降低急性冠脉综合症患者斑块的不稳定性［12］;在ApoE－/－小鼠AS模型上，FLAP在主动脉中上调最多，FLAP抑制剂MK-886可明显降低斑块面积。

Fig 5 Effect of ligustrazine on the protein expression of p-STAT3 in coronary endothelial cells induced by LPS(±s，n=4)

本研究在LPS诱导体外AS炎症反应模型上的结果表明，LIG可有效抑制LPS诱导的内皮细胞COX-2、5-LOX及 FLAP蛋白表达，且与其阻断MAPK磷酸化激活密切相关。因此，抑制AA通路炎症反应，改善内皮功能是LIG抗AS关键始动环节。

3.2 抑制MAPK和JAK2/STAT3通路活化为其抗AS形成的新途径 MAPK信号途径的激活很可能是各种致AS病变因素的共同通路，p38MAPK途径参与对炎症因子、黏附分子的调控，促进AS进程。MAPK磷酸化水平升高与AS患者颈动脉斑块内膜增厚关系密切。有研究表明，AA可通过MAPK激活蛋白激酶2促进5-LOX在Ser-271部位的磷酸化，促进炎症反应［13］。本研究表明，LIG通过下调p38MAPK磷酸化而抑制LPS诱导的内皮细胞AA通路炎症因子 COX-2、5-LOX及 FLAP表达，p-p38MAPK特异性抑制剂SB203580逆转LIG的内皮保护作用。提示，LIG抑制LPS诱导的内皮AA通路激活是通过MAPK通路实现。

抑制内皮细胞JAK2/STAT3通路的激活，可明显抑制EC炎症反应，对抗EC损伤，有报道，JAK2特异性抑制剂AG490可明显抑制牛主动脉EC中LDH渗出，降低黏附分子 PECAM-1表达，抑制STAT3磷酸化激活［14］。本研究中，LIG通过下调STAT3磷酸化蛋白的表达而抑制LPS诱导的内皮损伤作用，JAK2特异性抑制剂AG490可翻转LIG的内皮保护作用。提示抑制JAK2/STAT3通路激活是LIG抗LPS诱导内皮AA通路炎症反应的另一新型通路。因此，抑制内皮MAPK和JAK2/STAT3通路激活为LIG抗AS形成的新途径。

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