李强，佟丽，谢扬（1.南方医科大学药学院，广州510515；.南方医科大学中医药学院，广州510515）

过山枫（Celastrus aculeatus Merr.）为卫矛科南蛇藤属植物，药用部位为根和藤茎，具有祛风除湿、行气活血、消肿解毒等功效，我国民间长期使用过山枫来治疗风湿痹痛等证[1]。现代药理学研究证明，过山枫乙醇提取物具有抗类风湿性关节炎和免疫调节作用[2，3]。补体系统非正常激活会引起类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病[4，5]。天然产物中多糖类补体抑制剂的研究和开发备受到国内、外学者的广泛关注[6]。Zhu HW等[7]和Xu H等[8]对杜仲、柴胡多糖的研究表明，其具有抗补体活性作用。目前，国内、外仍未见关于过山枫多糖（CAP）药理作用研究的报道。本研究首次制备CAP，并对其理化性质和抗补体活性做初步探讨。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Eppendoff 5810 R型低温高速离心机（德国Eppendoff公司）；TECAN GENios Pro型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；CHB-100型恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）；Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

1.2 试药

过山枫根和藤茎采自广州市增城区，经中国科学院华南植物研究所叶华谷研究员鉴定为真品，样本保留在中国科学院华南植物研究所样本馆，编号为10943。抗绵羊红细胞抗体（溶血素，效价为1∶4000，浙江玉环县南方试剂厂）；肝素钠（广州斯佳生物科技有限公司，含量：150 μg·mg－1）；三蒸水、去离子水为笔者自制；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物与细胞

豚鼠2只，♂，体重500～700 g，由南方医科大学实验动物中心提供（动物生产许可证号：SCXK（粤）2006-0015）。绵羊红细胞（浙江玉环县南方试剂厂）。

2 方法

2.1 CAP的制备

干燥的过山枫藤茎粉末（200 g）依次用丙酮、甲醇索式提取各12 h，脱脂。倒出残留物，于50℃干燥24 h。加10倍量水于干燥的过山枫残留物中，80℃提取3次，每次3 h。抽滤，滤液合并减压浓缩，浓缩液10000 r·min－1离心10 min，取上清液加4倍量95%乙醇4℃静置过夜，3000 r·min－1离心5 min后，沉淀重复水溶醇沉步骤2次。沉淀用去离子水复溶，用Sevage试剂（氯仿∶正丁醇＝4∶1，V/V）去蛋白4次，水溶液部分装入透析袋（截留分子量：3500 Da），在去离子水中4℃透析48 h，透析液冷冻、干燥，获得CAP。

2.2 CAP的理化性质

2.2.1 CAP中多糖的含量测定 按苯酚-硫酸法测定，精密称取无水葡萄糖54 mg，溶于去离子水中并定容至500 mL，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，加水稀释至2.0 mL后，依次加入6%苯酚1.0 mL和浓硫酸5.0 mL。静置10 min，摇匀，室温放置20 min后于490 nm波长处测定吸光度，取2.0 mL去离子水按同法显色作为空白，以葡萄糖浓度（x，μg·mL－1）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，制备标准曲线。

精密称取CAP 5.8mg，去离子水溶解，并定容至50mL。取CAP溶液1.0 mL，按上述步骤操作，测定其吸光度，以标准曲线计算多糖含量。

2.2.2 CAP的波谱分析 取CAP 2 mg，与KBr研磨混合后，经压片机压成透明薄片，采用傅里叶变换红外光谱仪扫描分析，以KBr空白片作参比，扫描范围4000～400 cm－1。取CAP近饱和溶液，以蒸馏水为空白对照，于紫外-可见光谱205～400 nm波长区域扫描。

2.3 豚鼠补体效价测定

取一定量豚鼠血清，加入明胶巴比妥（GVB2+）缓冲液制备成1∶20浓度的溶液，并依次对倍稀释为1∶40～1∶640浓度的溶液。取稀释好的豚鼠血清0.1 mL，与等体积溶血素和绵羊红细胞混匀，不足部分以GVB2+缓冲液补至0.6 mL。37℃金属浴30 min，4℃下4000 r·min－1离心10 min，取上清液在570 nm波长处测定吸光度。以0.1 mL绵羊红细胞与0.5 mL GVB2+缓冲液组成空白管的吸光度作为0%溶血，以0.1 mL绵羊红细胞与0.5 mL三蒸水组成的全溶血管的吸光度作为100%溶血，计算每管溶血百分率，并制备溶血曲线。根据试验结果确定豚鼠血清补体效价。选择合适的稀释度的豚鼠血清进行后续试验。

2.4 CAP的抗补体活性

分别取0.l mL稀释度为1∶2～1∶64的CAP溶液与等体积的适宜稀释度的豚鼠血清、溶血素和5%绵羊红细胞混合，不足部分以GVB2+缓冲液补至0.6 mL，其余部分按“2.3”项下方法操作。以肝素溶液为阳性对照。按如下公式计算溶血率，并绘制溶血曲线：

溶血率＝Ac－（As－Ap）/Ac×100%

式中，As为加多糖样品溶液的溶血体系在570 nm波长处的吸光度；Ap为不同稀释度的CAP与GVB2+缓冲液的对照在570 nm波长处的吸光度；Ac为GVB2+缓冲液、血清和致敏绵羊红细胞的上清液在570 nm波长处的吸光度。

3 结果

3.1 CAP的性状和多糖含量

过山枫经脱脂，水提醇沉，Sevage法去蛋白，冷冻、干燥获得一种桔红色絮状固体物质，即CAP。用不同浓度的葡萄糖溶液经苯酚-硫酸法检测其吸光度，获得的回归方程为y＝0.016 x－0.0038（r＝0.9997）。CAP经苯酚-硫酸法检测其多糖含量为58.3%。

3.2 CAP的波谱分析

在260 nm波长处没有吸收峰，表明CAP中无核酸；而在280nm波长处有一个肩峰，表明CAP是与蛋白质复合的多糖。3383.6 cm－1处宽而强的吸收峰代表了羟基的伸缩振动；2933.5 cm－1处弱的吸收峰是由于C-H的伸缩振动和弯曲振动造成的；在1646.8cm－1处为水的振动吸收峰；在1200～1000 cm－1的区域为吡喃环的醚键（C-O-C）和羟基的变角振动吸收峰；1021.9、1078.8、1154.8 cm－1是α-吡喃糖的特征吸收峰，934.7 cm－1处吸收峰为α-D-Glcp的特征吸收峰，847.5 cm－1吸收峰为α-端基差向异构的C-H变角振动[9]。这说明，CAP主要由α-吡喃糖构成，含有α-D-Glcp。CAP的紫外-可见光谱见图1；CAP的红外光谱见图2。

图1 CAP的紫外-可见光谱Fig 1 UV visible spectrum of CAP

3.3 补体效价的测定

在补体稀释浓度为1∶40时，体系基本达到全溶血，在1∶80时，溶血率开始下降。所以选择补体稀释浓度为1∶40，确保体系能够全部溶血。不同稀释倍数的补体溶血率曲线见图3。

3.4 CAP对补体的作用

图2 CAP的红外光谱Fig 2 IR spectrum of CAP

图3 不同稀释倍数的补体溶血率曲线Fig 3 Hemolysis rate curves of various dilutions of complement

CAP稀释浓度为1∶4时仍能完全抑制溶血，在1∶4～1∶32（浓度为913～114 μg·mL－1）范围内产生突跃达到基本完全溶血。经计算，不同稀释倍数的补体溶血率曲线的半数溶血浓度（CH50）为302 μg·mL－1，而肝素的 CH50为699 μg·mL－1。不同稀释倍数的补体溶血率曲线的抗溶血活性远大于肝素。不同浓度的CAP和肝素对补体溶血体系的影响见图4。

图4 不同浓度的CAP和肝素对补体溶血体系的影响Fig 4 Effect of various concentrations of CAP and heprin on hemolysis system of complement

4 讨论

由于CAP本身具有颜色，造成最终体系的吸光度实际是由溶血吸光度和CAP吸光度两部分构成。为了消除这一影响，将不同稀释度的CAP与缓冲液混合，同样金属浴离心测吸光度作对照。在计算溶血百分率时，先将CAP的吸光度从体系中扣除然后计算。

类风湿性关节炎等多种自身免疫疾病的发生、传导与补体过度激活有关，而补体亢进也在许多疾病中作为重要诊断指标，但目前市场上没有针对补体的抗炎症药物。补体抑制剂的研究越来越受到关注，大量文献表明，许多天然产物能有效地阻止补体激活，其成分主要存在于多糖、黄酮类和三萜类中[6]。其中多糖类生药来源充足，可以从中寻找到无毒或低毒、廉价的抗补体药物。已报道具有抗补体活性的杜仲多糖EWDS-2的CH50值为282 μg·mL－1[7]，柴胡多糖D3-S1的CH50值为479 μ g·mL－1[8]，而CAP的CH50值介于两者之间，CAP抗溶血作用强于肝素，是一种潜在的抗补体药物。CAP抗补体作用的位点和CAP多糖的一级结构表征还有待进一步研究。

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