王志伟，傅红，*，杨琳，赖冬花

（1.福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350002；2.福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建 福州 350003）

2002年瑞典科学家发现富含淀粉类食品原料经高温（>120℃）加工后，会产生具神经毒素的丙烯酰胺[1]，随后各国的研究机构均证实了这个研究成果[2-3]。2005年4月，我国卫生部发布公告警告公众关注食品中的丙烯酰胺，呼吁采取措施减少食品中的丙烯酰胺含量以确保食品的安全性[4]。曲奇饼干由于具备高糖、高油脂、高温加工的特点，是丙烯酰胺含量较高的食品[5-6]。目前通用的检测方法包括GC、HPLC、MS及三者之间的结合技术[7]。不过，由于食品成分的差异性，特别是针对于油脂和碳水化合物较高的基质，丙烯酰胺的快速准确检测方法仍然是食品分析工作者面临的难题。本研究在以往检测方法的基础上，通过筛选前处理条件[8-10]，确定了一种有效的曲奇饼干中丙烯酰胺HPLC检测的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪，配有可变波长检测器（VWD）：美国 Agilent公司；Mil1i-Q 超纯水机：美国Millipore公司；LG4000-G3旋转蒸发仪：美国Heidolph公司；Oasis HLB，3cc.60mg：美国 Water公司；MG-2200氮吹仪：日本EYELA公司；3-30K高速离心机：安捷伦科技有限公司；MMV-1000W分液漏斗振动器：日本EYELA公司；T25高速分散机：IKA公司。

丙烯酰胺标准品（纯度大于99%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸（96%）、甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯；其他试剂均为国药分析纯。

1.2 方法

1.2.1 曲奇饼干的制作

低筋粉 100 g，白糖 35 g，黄油 50 g，盐 0.7 g，奶粉5 g，鸡蛋 25 g，小苏打 0.5 g，经搅拌、调粉[11]。每个面团称取 5 g（精确至 0.01 g），采用特定的模具（7.6×4.6×2.4 cm）压制成型，然后在190℃条件下烘焙7 min，得到的饼干样品冷却后装入自封袋中，研磨待测。

1.2.2 丙烯酰胺的测定

1.2.2.1 标准溶液的配制

准确称取10 mg（精确到0.0001 g）丙烯酰胺标准品于10 mL棕色容量瓶中，二次超纯水定容至刻度，得到1 mg/mL浓度的标准液，并于4℃冰箱保存。临用时配制浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL 的标准使用液。

1.2.2.2 样品处理

[10]，称取2.00 g经研磨充分的样品于100 mL带盖聚丙烯离心管中，分别加入（25，250，500μg/kg）丙烯酰胺标准品以确定方法的加标回收率，静置10 min。加入10 mL正己烷，涡旋混合2 min，弃去上层液（重复操作一次），电吹风吹干。分别加入10 mL 0.1%CHOOH和10 mL 2 mol/L NaCl提取液，均质5 min，于50℃水浴中超声振荡20 min，10000 r/min，4℃离心20 min。收集上清液于150 mL分液漏斗中，样品残渣加入10 mL 2 mol/L NaCl重复提取过程，合并上清液，混匀备用。

样品提取液中加入乙酸乙酯充分萃取（30 mL×3，振荡频率280r/min，10min），合并乙酸乙酯层至150mL梨形瓶，于35℃，真空度150 mbar下减压浓缩至约1 mL，将浓缩液转移至10 mL玻璃试管中，梨形瓶中加少量乙酸乙酯充分涤荡3次，合并至试管中，50℃氮气吹干，迅速加入2 mL超纯水重溶并涡旋混合。重溶液过0.45μm水系滤膜，再经过Oasis HLB萃取小柱（依次用1 mL CH3OH和1 mL超纯水活化），弃去前流出液（约7滴～8滴），收集后续液于进样瓶中，上机测定。

1.2.2.3 色谱条件

参考文献[12]，根据实验室现有的色谱柱Kromasil ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）确定色谱条件：流动相：甲醇-水（5∶95，体积比），流速 0.8 mL/min；检测波长：210 nm，柱温 25℃，进样量 5μL。

根据标样的保留时间，对样品所得色谱图进行定性分析。通过色谱仪工作站数据处理系统，对目标物按外标法进行定量分析，计算样品中丙烯酰胺的含量。

2 结果与讨论

2.1 HPLC流动相的选择

根据实验室现有的Kromasil ODS色谱柱，通过改变流动相中甲醇的比例，来调整丙烯酰胺的保留时间。当选用甲醇-水（5∶95,体积比）为流动相时，丙烯酰胺的出峰时间在5.240 min左右（图1）。随后对样品液进行上机测定，目标物能够很好的与干扰峰实现分离（图 2），最终确定流动相组成为甲醇-水（5∶95，体积比）。

图1 丙烯酰胺标准样色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of acrylamide standard

2.2 线性关系及检测限

图2 样品中丙烯酰胺检测色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of acrylamide in sample

以系列标准溶液进样，以标准物浓度横坐标，对应峰面积为纵坐标进行线性回归分析，由仪器自动积分得到线性回归方程：Y=35.86 X+0.2576，线性系数为0.99980，在测定范围内（0.2μg/mL～1.0μg/mL）线性关系性良好。根据3倍信噪比（S/N），计算该方法的检出限为 4.5（ng/mL）；定量限为 14.5（ng/mL）。该范围覆盖了大部分食品中丙烯酰胺的含量，能够满足本实验的分析要求。

2.3 丙烯酰胺提取温度的选择

本实验比较了 25、45、50、55、75 ℃温度对丙烯酰胺提取效果的影响，结果见图3。

随着温度的提高，丙烯酰胺的检测值略有升高，温度大于50℃时，检测值趋于稳定；其中50℃时的检测值比25℃时提高了14.9%。同时，随着提取温度的升高，水相与有机相分层良好，萃取液澄清。最终选择丙烯酰胺的提取温度为50℃。

2.4 丙烯酰胺提取料液比的选择

试验中每克样品分别用10、15、20 mL提取溶剂（0.1%甲酸∶2 mol/L NaCl溶液=1∶2，体积比），按照1.2.2.2的方法进行操作，结果见图4。

对于单级提取，提高料液比从10到20对丙烯酰胺得率的影响不显著；当料液比为15时，采取两级提取比单级提取的检测值提高了6.8%，并且获得最大的检测值，在节约成本的同时，对丙烯酰胺的提取更加充分。实验确定采用两次提取，料液比为1∶15（g/mL）。

2.5 乙酸乙酯萃取次数的选择

分别采用不同的萃取次数（1、2、3）对提取液中的丙烯酰胺进行乙酸乙酯液液萃取，比较不同萃取次数对丙烯酰胺检测值的影响，结果如图5所示。

丙烯酰胺的检测值随萃取次数的增加而升高，与1次萃取比较，采用3次萃取能够使检测值提高51.6%。这说明充分的萃取可以确保丙烯酰胺最大限度进入有机相中，从而保证检测结果的准确性，故将萃取次数确定为3次。

2.6 正交试验

按照（1.2.2.2）方法步骤，选取提取时间、料液比和萃取次数为影响因素，各取3个水平设计L9（34）正交试验，每组实验重复3次（加标水平250μg/kg），以回收率为指标对丙烯酰胺的提取条件进行优化。结果如表1所示。由表1的极差分析可知，以丙烯酰胺的回收率为指标时，各因素对其提取效果的影响程度依次为C>A>B。即乙酸乙酯萃取次数>提取温度>料液比，最佳组合C3A2B2，即萃取次数3次，提取温度50℃，料液比1∶15，正好是正交表中实验5，即实验具有良好可行性，不需做验证实验。

2.7 方法精密度与加标回收率

目前国内外有关食品中丙烯酰胺提取的过程，通常是在室温条件下，以1∶10料液比进行单级提取[13-14]，而本研究在提取过程中结合加热和二级提取步骤，为了比较两种提取效果的差异，结合正交试验的结果，在实验中加分别选取室温（25℃）、料液比1∶10（g/mL）单级提取、3次萃取操作和提取温度50℃、料液比1∶15（g/mL）二级提取，3次萃取操作进行预处理。各加标水平（25、250、500μg/kg）进行 3 次平行测定，以加标回收率表示方法的准确度，RSD表示方法的重复性和精密度，结果见表2。

表1 正交试验结果Table 1 The results of orthogonal experiment

表2 两种预处理方法加标回收率结果比较（n=3）Table 2 The comparison of recovery of assay for acrylamide by two pretreated methods(n=3)

3 结论

本研究建立了一种曲奇饼干中丙烯酰胺的HPLC-VWD检测方法。通过优化前处理条件，使方法的平均加标回收率从86.6%提高到90.9%。该方法可以对样品中的丙烯酰胺进行快速准确的定量分析，每个样品的走样时间约为 5 min，在 0.2μg/mL～1.0μg/mL范围内具有良好的线性关系和重复性，同时减少了对昂贵的质谱检测设备的依赖，使用的实验设备价格相对低廉，容易被大多数实验室所采纳，有助于在食品检测行业的推广应用。不过，由于食品基质之间存在很大的差异性，以后的研究重点仍将集中在复杂基质的预处理过程。

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