任玉锋，马爱瑛，刘雅琴，韩培杰

（北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021）

灵武长枣（Zizphus jujubamill cv.lingwuchangzao）是宁夏灵武有地方特色的优良枣品种，其个大、色艳、果肉致密酥脆、酸甜适口，鲜枣含糖量高，VC含量达3 g/kg～4 g/kg，是集营养、保健于一体的优质果品，是宁夏优势特色水果之一。但灵武长枣与其他枣类一样，在自然条件下贮藏比较困难，鲜销期只有半个月左右，在贮藏中因真菌病害侵染而导致的腐烂率达30%～40%[1]，严重制约了宁夏红枣产业的发展。甘瑾等从贮藏的灵武长枣中分离并采用形态学的方法鉴定出了贮藏过程中引起腐烂病害的四种主要病原真菌[1]。本试验以灵武长枣为主要研究对象，分离和筛选出引起灵武长枣采后腐烂的主要致腐病原真菌，并用形态学和分子生物学的方法相结合对之进行鉴定,为进一步研究灵武长枣采后生理及保鲜技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基；（PDA培养基）：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1000 mL。

1.1.2 主要仪器设备

立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50KBS型）：上海申安医疗器械厂，上海；恒温恒湿培养箱（HWS智能型）：宁波江南仪器厂，宁波；双人单面洁净工作台（SW-CJ-2FD）：苏州苏洁净化设备有限公司，苏州；光学显微镜（CX31RTSF）：Olympus，日本，等。

1.1.3 实验材料

灵武长枣：产自宁夏灵武市灵河镇二道沟村枣园；引物：由 TaKaRa公司合成；Tap酶、dNTP：均购自TaKaRa公司。

1.2 灵武长枣采后主要病原真菌的分离

参照甘瑾等的方法分离灵武长枣采后主要病原真菌[1]。

1.3 灵武长枣采后主要病原真菌的鉴定

1.3.1 形态学的鉴定

根据病害症状、菌落形态及菌丝、孢子、孢子器等的特征来确定病原菌的种属。

1.3.2 灵武长枣主要病原真菌rDNA-ITS序列分析

1.3.2.1 总DNA的提取

参照庄得凤等的CTAB方法提取菌株的总DNA[2]。

1.3.2.2 rDNA-ITS序列的扩增

扩增 ITS区（以 ITS1：5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3’和 ITS4：5’-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3’为引物）的 rDNA 序列，反应体系 50μL（5μL PCR buffer（10×PCR buffer），4μL dNTPs（2.5 mmol/L），1μL模板 DNA，上下游引物各 1μL，0.25μL Taq，加 ddH2O至50μL。PCR程序：94℃预变性5 min后，30个循环包括 94℃50s，51℃50s、72℃2min，72℃延伸 10min。反应完成后，-20℃保存备用，0.8%琼脂糖电泳检测。将PCR产物纯化后直接测序（测序由大连宝生物公司完成）。将获得的基因序列在NCBI数据库进行BLAST。

2 结果与分析

本实验共分离到4种典型菌株，分别记录为A、B、C、D。

2.1 灵武长枣采后主要病原真菌的形态学鉴定结果

将从贮藏的灵武长枣果实上分离出A、B、C、D 4种病原真菌，挑取各菌落少许到载玻片上，制片并用显微镜观察、测量、拍照，根据各病原菌的形态特征对其进行鉴定。

2.1.1 病原菌A形态及培养性状观察

病原菌A形态及培养性状观察，见图1。

由图1的A1、A2、A3、A4可见，病原菌A菌落黑灰色；有发达的假根和匍匐枝，菌丝无隔，孢囊梗较长，自假根伸出单根而不分枝，末端突入孢囊内与孢囊相接，1～10枝丛生于假根上；孢子囊为球形，孢囊孢子形状不规则，孢子大小 10μm～20μm，依据文献[1，3]初步鉴定为黑根霉（Rhizopus stolonifer），是长枣采后最严重的致病菌。

图1 病原真菌A形态及培养性状Fig.1 Form and culture character of pathogenic fungi A

2.1.2 病原菌B形态及培养性状观察

病原菌B形态及培养性状观察，见图2。

图2 病原真菌B形态及培养性状Fig.2 Form and culture character of pathogenic fungi B

由图2的B1、B2、B3、B4可见，病原菌B菌落墨绿色；菌丝有隔单核，分生孢子梗直立，顶端1至多次分枝呈扫帚状，分枝上产生3轮不对称的瓶状小梗，其顶端着生成串的分生孢子，球形，呈念珠状，一般5～20个成串相连，孢子直径 2μm～3μm。依据文献[1，3-4]初步鉴定为青霉属（Penicillium sp.）的真菌。

2.1.3 病原菌C形态及培养性状观察

病原菌C形态及培养性状观察，见图3。

由图3的C1、C2、C3、C4可见，病原菌C菌落成圆形灰褐色，边缘不规则白色；菌丝有隔；分生孢子梗丛生，分生孢子有倒棍棒形、卵形或椭圆形，常带有短圆形喙，分生孢子一般有横隔，少数有纵隔，孢子大小 30μm×10μm；依据文献 [1，3]初步鉴定为链格孢[Alternaria alternata（Fr.）Keissl]。

图3 病原真菌C形态及培养性状Fig.3 Form and culture character of pathogenic fungi C

2.1.4 病原菌D形态及培养性状观察

病原菌D形态及培养性状观察，见图4。

图4 病原真菌D形态及培养性状Fig.4 Form and culture character of pathogenic fungi D

由图4的D1、D2、D3、D4可见，病原菌D菌落边缘白色，有同心圈纹，表面有小水粒；菌丝有隔，分生孢子梗直立，不分枝，分生孢子1～2个顶生。分生孢子洋梨形，双细胞分隔处略缢缩，孢子基部有一乳头状突起。被病原菌侵染的枣果初期为白色，后期变为粉红色，枣果表皮干燥。依据文献[1，3]初步鉴定为粉红聚端孢[Trichoderma roseum（Pers.）Link]。

2.2 灵武长枣采后主要病原真菌rDNA-ITS序列分析

经琼脂糖凝胶电泳检测，分离得到的4种真菌的PCR反应体系产物均为单一条带，如图5所示。

图5 ITS扩增电泳图Fig.5 了Amplification Electrophoretogram of ITS

PCR产物直接纯化测序后，序列测定片段产度分别为：ITS序列PCR扩增条带大小约700 bp。把所得到序列提交到GeneBank数据库，进行BLAST比较，A 的 ITS序列与 Rhizopus stolonifer（AM933544）同源性为100%、B的ITS序列与penicillium crustosum（HQ026728）同源性为99%、C的ITS序列与Alternaria alternata（GQ121322）同源性为 99%、D 的 ITS序列与Trichothecium roseum（HQ115655.1）同源性为99%。

3 结论

本实验采用形态学和rDNA-ITS序列分析法相结合的方法，从采后贮藏的灵武长枣中分离鉴定出4种主要病原真菌进行鉴定。真菌rDNA序列分析用于真菌系统分类通常通过多聚酶链式反应（PCR）技术实现。PCR技术在真菌分类与鉴定中有独特的优点，如快速、灵敏、需样品量少等。RENSKE等[5]认为真菌通过rDNA-ITS区域比对，序列相似性大于99%，鉴别为同种；序列相似性大于95%且小于99%，鉴别为相同属；序列相似性小于95%，鉴别为同科，因此结合菌株形态学特征，可以初步鉴定此4株病原真菌分别为：黑根霉（Rhizopus stolonifer）、皮落青霉（penicillium crustosum）、链格孢[Alternaria alternata（Fr.）Keissl]和粉红聚端孢[Trichoderma roseum（Pers.）Link]，其中从贮藏的灵武长枣中分离出链格孢和粉红聚端孢已有资料报道[1]，而黑根霉、皮落青霉为在灵武长枣中首次分离得到病原真菌。

[1]甘瑾,唐文林,潘禄,等.灵武长枣采后病原菌的分离及天然抗菌物质的筛选[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2007,35(10):81-86

[2]庄得凤,曹后男,周兰,等.长白山杜鹃花基因DNA提取及RAPD体系的建立[J].湖北农业科学,2008,47(3):17-20

[3]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979:358-552

[4]陈苹,戴好富,解修超,等.海南粗榧内生真菌的分离与初步鉴定[J].微生物学通报.2008,35(9):1455-1460

[5]Landeweert R,Leeflang P,Kuyper TW,et al.Molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(1):327-333