周燕芳，刘丹凡

（韩山师范学院化学系，广东 潮州 521041）

草鱼，俗称鲩、油鲩、草鲩、白鲩、草根、混子、黑青鱼等，属淡水鱼，栖息于平原地区的江河湖泊，一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域。性活泼，游泳迅速，常成群觅食，为典型的草食性鱼类，在干流或湖泊的深水处越冬。草鱼因其肉细嫩、味鲜美、生长迅速，饲料来源广，产量大、单产高、价格适中以及质量上乘，是中国淡水养殖的四大家鱼之一，也是市场的畅销货[1]。

草鱼富含丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、硒等营养元素，具有很高的营养价值和药用价值。本试验采用木瓜蛋白酶水解（以下简称酶解）草鱼，并对酶解的工艺条件进行研究，目的是确定最佳的酶解工艺条件,以便获得品质较高的酶解液,为草鱼功能食品开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

草鱼：购于潮州市桥东市场，为淡水养殖草鱼。

木瓜蛋白酶（BR，酶活力9.35 kat/mg）：国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器

电热鼓风干燥箱：上海仪器试验有限公司；JJ-2型组织捣碎机：江苏省金坛市荣华仪器有限公司；501超级恒温槽：上海恒平科学仪器有限公司；800型离心机：上海手术器械厂；85-2恒温磁力搅拌器：常州国华仪器有限公司；FA2004N电子天平：上海精科；数显精密pH计：上海手术器械厂；微量凯氏定氮仪。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

新鲜草鱼→蒸熟→压榨去脂肪→65℃烘干→捣碎→鱼粉（备用）→称量→加水稀释→调pH→加入一定量的酶搅匀→加温酶解一段时间→灭酶（沸水中15 min）→冷却至室温→离心（15 min）→收集所有上清液定容至100 mL→取10 mL测定游离氨基态氮

1.2.2 测定方法

蛋白酶活力的测定[2]：福林酚法；氨基态氮的测定：双指示剂甲醛滴定法[3]；总氮量的测定：微量凯氏定氮法[4]；水解度的测定[5]：水解度（DH）=水解产生游离氨基态氮量÷原料总氮量×100%；其中“水解产生游离氨基态氮量=水解后酶解液中的游离氨基氮-鱼粉中的游离氨基氮”。

1.2.3 试验设计[6-7]

酶浓度、底物浓度、酶解时间、pH和水解温度为影响蛋白质酶解的主要因素。本试验先通过考察各单因素对木瓜蛋白酶水解草鱼的水解效果影响，以水解度为衡量指标，确定各单因素的最适宜酶解条件，再采用正交试验L9（34）综合研究，确定木瓜蛋白酶水解草鱼的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 酶解单因子影响的研究[8-10]

影响酶促水解反应的因素很多，诸如酶浓度、底物浓度、酶解时间、pH和水解温度等。即使同一种酶在水解不同底物时，水解的条件也不尽相同，所以应首先对酶水解条件进行单因素分析。

2.1.1 酶用量对水解度的影响

分别用酶用量为鱼粉质量的0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，在底物浓度为2.00%，pH为7.0，水解温度55℃，水解时间为4 h条件下进行酶解反应，研究酶浓度对水解度的影响，结果见图1。

图1 酶浓度对水解效果的影响图Fig.1 Effect of density of protease on hydrolyzation

由图1可知，随着酶用量的不断提高，草鱼蛋白的水解度逐渐增加，但当木瓜蛋白酶的浓度达到一定程度后，水解度随着加酶量的变化趋势有所缓慢。因此综合考虑经济性等因素，酶的浓度不宜过高。所以，确定酶的使用量为鱼粉质量的1.5%左右。

2.1.2 底物浓度对水解度的影响

分别配制底物浓度为1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%、3.50%的草鱼浆液，调节其pH为7.0，酶用量为1.5%，55℃下酶解4 h后测定其水解度，找出最佳的底物浓度，结果见图2。可知，随着底物浓度的增加，草鱼的水解度有所下降，这主要是因为在低浓度时，溶质流动性好，但酶和底物的浓度较低，反应进行比较慢；在高浓度时，溶质流动性差，体系的有效水浓度降低，导致酶与底物的接触不充分，限制了反应的进行。因此，综合各个方面的因素，本实验选取底物浓度为2.50%进行酶解反应条件的研究。

图2 底物浓度对水解效果的影响图Fig.2 Effect of density of substretum on hydrolyzation

2.1.3 水解时间对水解度的影响

在实验中设定木瓜蛋白酶酶用量为1.5%，底物浓度为2.50%，pH为7.0，反应温度为55℃，分别在酶解时间为 1、2、3、4、5、6 h 条件下进行酶解反应，研究酶解时间对水解度的影响，结果见图3。

图3 水解时间对水解效果的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on hydrolyzation

由图3可知，随着酶解时间的延长，水解度逐渐提高，当达到一定时间（4 h）后，水解度的增加变得缓慢，基本上趋于不变。因此，从经济的角度出发，认为酶解的最佳作用时间不宜过长，为4 h左右比较合适。

2.1.4 pH对水解度的影响

选定木瓜蛋白酶酶用量为1.5%，底物浓度为2.50%，反应温度55℃，水解时间为4 h的条件下，分别于 pH=6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 中进行酶解反应，确定最佳酶解pH，结果见图4。

图4 pH对酶解效果的影响图Fig.4 Effect of pH on hydrolyzation

由图4可看出体系初始pH对水解度有一定的影响，在pH 6.0～7.0范围内，水解度随着pH的增加而提高，当pH大于7.0时水解度随着pH的增加反而有所下降。这就说明采用木瓜蛋白酶水解草鱼时,酶解液的最适pH为7.0。因此，本试验体系的起始pH固定在7.0。

2.1.5 温度对水解度的影响

设定木瓜蛋白酶酶浓度为1.5%，底物浓度为2.50%，水解时间为4 h，pH=7.0的条件下，分别于25、35、45、55、65、75 ℃等不同温度中进行酶解，通过水解度的具体数值确定最佳反应温度，结果见图5。

图5 温度对酶解效果的影响图Fig.5 Effect of temperature on hydrolyzation

由图5可见，在温度为25℃～65℃范围内水解度随着温度的升高而增大，当反应温度为65℃时，水解度最大。随着温度继续升高，水解度反而有所下降。这主要是由于温度对木瓜蛋白酶的影响，温度太高会使酶灭活，而温度过低则酶的活性不足，两者都会导致水解度的降低，因此最佳的酶解温度为65℃左右，这时酶的活性最高。

2.2 草鱼最佳酶解工艺条件的确定

根据以上单因素试验结果可知，酶浓度、底物浓度、酶解时间、pH和水解温度均对酶解效果有一定的影响。考虑到酶解过程是受以上各因素的综合影响，为了确定酶解的最佳条件及过程中各因素影响的大小，选取了酶浓度、底物浓度、酶解时间和水解温度4个因素，每个因素选取3个水平来进行正交试验，其中体系的pH采用固定值7.0，按L9（34）正交表进行正交试验，以水解度为指标，确定其最佳酶解条件。各因素及结果见表1。

表1 木瓜蛋白酶酶解草鱼蛋白L9（34）正交试验结果分析表Table 1 Orthogonal test of hydrolyzing Aristichthys nobilis by protease

续表1木瓜蛋白酶酶解草鱼蛋白L9（34）正交试验结果分析表Continue table 1 Orthogonal test of hydrolyzing Aristichthys nobilis by protease

从表1可知，各因素对木瓜蛋白酶酶解效果影响的大小顺序是：底物浓度>酶浓度>酶解温度>酶解时间。通过K值可知，最佳的酶解条件为A3B3C2D1，即酶浓度2.0%，底物浓度3.0%，酶解时间4 h，酶解温度60℃，在此条件下木瓜蛋白酶酶解草鱼蛋白的最大水解度为45.93%。

3 结论

采用木瓜蛋白酶对草鱼鱼肉蛋白进行水解，水解效果较好，可以获得水解度较高的酶解液。通过对单因素的考察，再结合正交试验可以确定出木瓜蛋白酶水解草鱼的最佳酶解条件是：酶浓度为2.0%，底物浓度为3.0%，酶解时间为4 h，pH为7.0，酶解温度为60℃，在此条件下木瓜蛋白酶酶解草鱼蛋白的游离氨基态氮含量为498.85 mg/L，水解度可达到45.93%。

[1]任娇艳,赵谋明,崔春,等.基于响应面分析法的草鱼蛋白酶解工艺[J].华南理工大学学报,2006,34(3):95-100

[2]天津轻工业学院,大连轻工业学院,无锡轻工业学院,等.工业发酵分析[M].北京:中国轻工业出版社,1999:85-87

[3]涂宗财,陈剑兵,刘伟,等.酶解鱼鳞胶制备小分子多肽的研究[J].食品科学,2005,26(8):210-212

[4]杨惠芬.GB5009.6-1985食品卫生理化检验手册[S].北京:中国标准出版社,1998,1:52

[5]陈晶,熊善柏,李洁,等.白鳞鱼骨蛋白酶水解工艺研究[J].食品科学,2006,27(11):326-330

[6]殷金莲,孙卉,谢顺虎,等.鲤鱼酶解液化技术研究[J].西北农林科技大学学报,2007,35(6):60-64

[7]周燕芳.鲫鱼水解条件的研究[J].食品研究与开发,2008,29(8):77-79

[8]卢珍华,郭彩华.木瓜蛋白酶水解绿豆蛋白制备可溶性肽的研究[J].食品工业科技,2005,26(11):56-58

[9]云霞,张彧,朱蓓薇,等.酶解玉米黄粉制备多肽的工艺研究[J].食品工业科技,2002,23(11):69-71

[10]周燕芳,刘锦浩.木瓜蛋白酶水解鳙鱼[J].食品研究与开发,2010,31(3):55-57